Flash and Freeze
神經(jīng)科學(xué)的一個(gè)基本問題是:突觸的結(jié)構(gòu)和功能特性之間的關(guān)系是什么?在過去的幾十年里,，電生理學(xué)已經(jīng)闡明了突觸的傳導(dǎo)機(jī)制，而電子顯微鏡(EM)使人們對(duì)突觸的形態(tài)有了更深入的了解,。將突觸生理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來的方法可以追溯到20世紀(jì)中期,，目的在于獲得突觸傳遞的圖像，即從電鏡拍攝的靜態(tài)圖片中捕捉動(dòng)態(tài)過程,。其中一種被稱為“閃光與凍結(jié)”（flash and freeze）的技術(shù),，結(jié)合了高壓冷凍（high-pressure freezing，HPF）,，對(duì)識(shí)別出的突觸前神經(jīng)元的光發(fā)生刺激,。
圖1 “閃光冷凍”示意圖
今天為大家介紹一種新穎的、可用于完整的哺乳動(dòng)物急性腦切片和器官切片培養(yǎng)的快速和冷凍方法,，該方法探索了小鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞（gyrus granule cell）與CA3錐體神經(jīng)元之間的海馬苔蘚纖維突觸（hippocampal mossy fiber synapse）的結(jié)構(gòu)和功能,，囊泡池的變化。
內(nèi)容摘要神經(jīng)科學(xué)的主要重點(diǎn)是進(jìn)一步理解突觸的結(jié)構(gòu)和功能,，以及兩者之間的關(guān)系,。盡管對(duì)突觸傳遞的認(rèn)知有了重要進(jìn)展，但仍有許多問題沒有得到解答,。由于中樞突觸的分子組成,、結(jié)構(gòu)和功能高度多樣化,，因此對(duì)突觸進(jìn)行分析對(duì)逾越這些知識(shí)鴻溝大有裨益。
電鏡提供了具有納米級(jí)別的空間分辨率,，然而它有一個(gè)很明顯的缺點(diǎn)就是只能捕捉靜態(tài)圖像,。為了分析活標(biāo)本中的突觸，通常使用共聚焦,、雙光子和超高分辨技術(shù)成像,，然而這些技術(shù)經(jīng)常用于離體培養(yǎng)的神經(jīng)元，很難達(dá)到足夠的分辨率來識(shí)別單個(gè)的激活區(qū)或單個(gè)突觸囊泡,。因此,，想要洞悉中樞突觸的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，需要尋找一項(xiàng)兼顧捕捉納米級(jí)空間和毫秒級(jí)時(shí)間分辨率的技術(shù),。
與以往報(bào)道方法不同的是,，這種改進(jìn)的“閃光與冷凍”技術(shù)，可應(yīng)用于急性切片和類器官切片培養(yǎng),。這些優(yōu)勢(shì)源于使用了薄的急性切片,、改進(jìn)后的載體幾何結(jié)構(gòu)、恢復(fù)方案及低溫保護(hù)和冷凍技術(shù),。
基于這一依據(jù),，這一技術(shù)被應(yīng)用于海馬齒狀回顆粒細(xì)胞（gyrus granule cell）與CA3錐體神經(jīng)元之間的海馬苔蘚纖維突觸（hippocampal mossy fiber synapse）。苔蘚纖維突觸具有大突觸末端,，形態(tài)超微結(jié)構(gòu)明顯,，突觸囊泡數(shù)量多，囊泡直徑變化大,，存在致密的核囊泡,。從生理學(xué)角度看，該突觸初始釋放概率低,、突觸可塑性高,。
實(shí)驗(yàn)方法選擇用于研究突觸前神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因小鼠，Prox1啟動(dòng)子靶向這些樣本的齒狀回顆粒細(xì)胞,。將pro1-creert2系與Ai32(ChR2(H134R)-EYFP)小鼠雜交,，選擇性表達(dá)通道型視紫紅質(zhì)。借助免疫熒光和共聚焦顯微鏡觀測(cè)EYFP在顆粒細(xì)胞中的選擇性表達(dá),。急性切片制備與器官切片培養(yǎng)方式如前所述,，使海馬苔蘚纖維保持好的狀態(tài)，以用于電生理學(xué)和高壓冷凍（HPF）實(shí)驗(yàn),。
首先,，對(duì)急性切片與器官切片培養(yǎng)中光刺激下的突觸傳導(dǎo)進(jìn)行了深入的電生理學(xué)特征分析，以確定“閃光冷凍”實(shí)驗(yàn)的參數(shù),，比如脈沖持續(xù)的時(shí)間和頻率,。為了匹配
EM ICE高壓冷凍系統(tǒng)，需注意控制刺激的功率和強(qiáng)度,。
圖2 優(yōu)化后的“閃光冷凍”技術(shù)工作流
接下來,，借助
EM ICE系統(tǒng)進(jìn)行高壓冷凍和光刺激，使用EM AFS或EM AFS2進(jìn)行冷凍替代,。用杜氏樹脂對(duì)切片和器官培養(yǎng)物進(jìn)行包埋,，然后用
EM UC7冷凍超薄切片機(jī)制成超薄切片。
最后用透射電鏡(TEM)觀察樣品,。根據(jù)苔蘚纖維的特性和形態(tài)差異,，在海馬CA3區(qū)發(fā)現(xiàn)了苔蘚纖維末端。重點(diǎn)分析對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中活動(dòng)區(qū)的著位囊泡的數(shù)量和直徑,，以及在半活動(dòng)區(qū)的潛在內(nèi)吞凹陷形成,。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果“閃光冷凍”電鏡的拍攝的HPF小鼠急性腦片海馬CA3區(qū)圖像如下：A)低倍鏡圖像顯示青苔狀纖維軸突(綠色箭頭)穿過透明層，CA3錐體神經(jīng)元樹突(藍(lán)色箭頭)穿過青苔狀纖維,，少量青苔狀纖維(紅色箭頭)位于這些樹突和軸突之間,。B)高倍鏡圖像顯示苔蘚纖維(紅色箭頭)布滿突觸囊泡和苔蘚纖維軸突(綠色箭頭)。優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)體系保留了急性切片的超微結(jié)構(gòu),，可媲美無光遺傳學(xué)刺激的HPF類器官腦片的超微結(jié)構(gòu),。
圖3 HPF急性切片的EM圖像
結(jié)果顯示，“未釋放”囊泡池（the docked vesicle pool）和在和“已釋放”囊泡池（the functionally defined readily releasable pool）之間有重疊,，即兩種囊泡具有共同的結(jié)構(gòu)和功能部分,，這為隨后突觸的快速內(nèi)吞作用提供了證據(jù)。
此外,，作者展示了中度刺激后內(nèi)吞的孔狀結(jié)構(gòu)外觀,，提供了快速網(wǎng)格蛋白獨(dú)立的內(nèi)吞機(jī)制的結(jié)構(gòu)證據(jù)。
圖4 結(jié)果示意圖
實(shí)驗(yàn)結(jié)論這項(xiàng)研究表明了了“閃光冷凍”技術(shù)的廣泛適用性,，可用于小鼠海馬組織的急性切片和器官切片培養(yǎng),，也可用于包括小腦和腦干在內(nèi)的多種大腦區(qū)域的急性切片。
總的來說,，這一整體升級(jí)后的“EM”技術(shù)可用于急性大腦切片突觸傳遞過程中的多個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的囊泡池變化（結(jié)構(gòu)和功能）機(jī)制研究,。
高壓冷凍儀 Leica EM ICE高壓冷凍能夠捕捉精細(xì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的錯(cuò)綜變化，結(jié)合光刺激或電刺激的高壓冷凍技術(shù)是您獲得新發(fā)現(xiàn)的平臺(tái),。
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References
- C. Borges-Merjane, O. Kim, P. Jonas, Functional Electron Microscopy, ‘‘Flash and Freeze,’’ of Identified Cortical Synapses in Acute Brain Slices, Neuron (2020) vol. 105, iss. 6, pp. 992–1006, DOI: 10.1016/j.neuron.2019.12.022.
- D. Vandael, C. Borges-Merjane, X. Zhang, P. Jonas, Short-term plasticity at hippocampal mossy fiber synapses is induced by natural activity patterns and associated with vesicle pool engram formation, Neuron (2020) vol. 107, iss. 3, pp. 509-521, DOI: 10.1016/j.neuron.2020.05.013.
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