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冠狀病毒因?yàn)榘ど厦懿贾愃迫彰岬募欢妹瑢儆诠跔畈《究?，正冠狀病毒亞科的冠狀病毒屬,。根?jù)血清學(xué)和基因組學(xué)特點(diǎn)，該屬名代表了α,、β,、γ和δ四個(gè)屬。目前已知感染人的冠狀病毒包括7種,，即α屬的普通冠狀病毒HCoV?229E和HCoV?OC43,，β屬的HCoV?NL63、HCoV?HKU1,、嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）-CoV和中東呼吸綜合征（MERS）-CoV,，以及此次導(dǎo)致武漢不明原因肺炎的2019-nCoV。其中,，HCoV?HKU1,、SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV可以導(dǎo)致人類肺炎,，其他是成人普通感冒的病原,，兒童較敏感，可致上呼吸道感染。

早在2008年的《Cell》中,，一組來自日本科學(xué)家發(fā)表了一篇題為《Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression》的文章,，文中表示：他們得到了兩種新型熒光蛋白，其中一種能使得G1期細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色,，而另一種使得S/G2/M期細(xì)胞核呈現(xiàn)出綠色,，研究人員將這些蛋白稱為熒光泛素化細(xì)胞周期標(biāo)志物（Fucci）。

 
早在2008年的《Cell》中,，一組來自日本科學(xué)家發(fā)表了一篇題為《Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression》的文章,，文中表示：他們得到了兩種新型熒光蛋白，其中一種能使得G1期細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色,，而另一種使得S/G2/M期細(xì)胞核呈現(xiàn)出綠色,，研究人員將這些蛋白稱為熒光泛素化細(xì)胞周期標(biāo)志物（Fucci）。

圖1 Cell封面圖片：處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞核發(fā)出紅色或綠色熒光


圖2 LMD-切割細(xì)胞的典型周期狀態(tài)
 

利用這一發(fā)現(xiàn),，來自德國(guó)吉森大學(xué)藥理學(xué)的Poppe與他的合作者們研究了冠狀病毒對(duì)細(xì)胞NF-κB通路和染色質(zhì)分布的影響,。
 
研究人員首先用HCoV-229E感染A549肺癌細(xì)胞模型，然后通過激光顯微切割（LMD6000）結(jié)合免疫熒光用于分解（i）被HCoV-229E感染的細(xì)胞,，（ii）與感染細(xì)胞緊鄰的細(xì)胞,，（iii）距離感染細(xì)胞至少150μm的細(xì)胞（“遠(yuǎn)端細(xì)胞”）和（iv）單獨(dú)的未感染的細(xì)胞。

圖3 細(xì)胞株示意圖

他們分離了表達(dá)冠狀病毒N蛋白的細(xì)胞,，并提取了整個(gè)RNA,。

圖4 借助免疫熒光和激光顯微切割分離細(xì)胞株

Laser microdissection實(shí)驗(yàn)過程：

• 細(xì)胞接種在加入2μm 青霉素（PEN）的30mm的圓形培養(yǎng)皿中。
• 免疫染色和LMD按照預(yù)定方案*進(jìn)行,，并進(jìn)行如下修改,。
• 處理結(jié)束時(shí)，細(xì)胞用Hank's平衡鹽溶液(HBSS)洗滌2次,，每次5分鐘,，并用2ml乙醇固定5分鐘。
• 在HBSS中洗滌30秒,，然后用2ml HBSS /0.1% Saponin加10%驢血清封閉,，孵育3分鐘。
• 稀釋1:50的N蛋白抗體或1:400的P(S2)-pol II,，在含0.1%皂素的400μm Hank’s BSS中37℃孵育,。
• 用Hank’s BSS/0.1%皂素洗滌30秒。
• 用y3抗體(1:50)和Dylight488二抗(1:400),，室溫400μl HBSS/0.1% Saponin,。
• 在2 ml HBSS中洗滌3次，每次30秒,，然后在2ml DEPC水中洗滌30次,，然后在40℃干燥30分鐘,。
• 使用Leica LMD6000系統(tǒng)將未感染的細(xì)胞和感染的細(xì)胞切除并收集在微量離心管中，用熒光顯微鏡檢測(cè),。

 
Leica激光顯微切割系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)

• 從病理樣本,、細(xì)胞樣本或涂片中，采用激光切割,、分離收集特定染色體,，細(xì)胞，組織,，從而進(jìn)行細(xì)胞的下游基因組,、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組,、或代謝組水平的分析及驗(yàn)證,。
• 可應(yīng)用于特定的單個(gè)染色體、細(xì)胞,、整個(gè)組織區(qū)域,，甚至骨骼、牙齒,、大腦,、植物等的切割分離。重力非接觸收集模式（Patent No.：DE10057292, EP1207392, JP3641454）清晰,、無污染,。可配備自動(dòng)高通量切割及收集模式,。操作過程中無需移動(dòng)樣品,，而是通過專激光光束任意掃描切割（Patent No.：EP1276586,、US7035004,、JP3996773），操作靈活,、便捷清晰干凈,。重力收集模式又很好地避免了樣品污染。
• 采用*的激光設(shè)計(jì)和易用的動(dòng)態(tài)軟件,，高達(dá)5000 Hz脈沖的349nm,，干凈、高效的切割目標(biāo)物邊緣,，而目標(biāo)物體無需接觸激光,，不受影響。
• 采用普通的0.2或0.5ml離心管即可收集,，耗材成本低,。

圖5 LMD切割示意圖

接著,，研究人員通過利用RT-qPCR和微陣列分析發(fā)現(xiàn)，與感染細(xì)胞緊鄰的細(xì)胞在單細(xì)胞水平上表征與存在于相同或不同培養(yǎng)物中的相鄰的未感染細(xì)胞相反,，感染后的基因表達(dá)發(fā)生了變化,。并通過HCoV-229E病毒N蛋白的免疫熒光（DMIRE2，DMi8）分析來監(jiān)測(cè)HCoV-229E感染并在A549細(xì)胞中擴(kuò)散,。
 
病毒學(xué)中熒光顯微鏡可以更好地滿足研究人員的需求,。然而，在對(duì)動(dòng)物組織進(jìn)行研究時(shí),，仍有機(jī)會(huì)進(jìn)行明場(chǎng)顯微鏡檢查,，比如檢查病毒感染后組織的形態(tài)變化等。
 
此外,，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中使用明視野顯微鏡檢查已經(jīng)感染或?qū)?huì)感染的細(xì)胞（DM IL,，DMi1，PAULA）的健康狀況和生長(zhǎng)狀態(tài),。

圖6 極化上皮細(xì)胞MDCK的明場(chǎng)圖像

Leica顯微鏡在病毒學(xué)中的應(yīng)用遠(yuǎn)不止這些,，而這些看似基礎(chǔ)的研究工作恰恰起到了直接作用。另外還有其他用于病毒可視化的技術(shù),，例如電子顯微鏡(EM)可以分解病毒顆粒,、單分子檢測(cè)(TCS SP8 SMD)、熒光壽命成像(FLIM) (STELLARIS 8 FALCON)以及多光子顯微鏡(SP8 DIVE)是適用于病毒學(xué)的其他方法,，這些今后為您介紹,。

參考文獻(xiàn)：
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[3] Mol Cell. 2014;53(2):193–208.
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