應(yīng)用專家 易海英
熒光是指熒光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)光照射下,，幾乎同時(shí)發(fā)射出波長(zhǎng)更長(zhǎng)光的過程(圖1)。當(dāng)特定波長(zhǎng)(激發(fā)波長(zhǎng))的光照射一個(gè)分子(如熒光團(tuán)中的分子)時(shí),，光子能量被該分子的電子吸收,。接著，電子從基態(tài)(S0)躍遷至較高的能級(jí),，即激發(fā)態(tài)(S1’),。這個(gè)過程稱為激發(fā)①。電子在激發(fā)態(tài)停留10-9–10-8秒,，在此過程中電子損失一些能量②,。電子離開激發(fā)態(tài)(S1)并回到基態(tài)的過程中③，會(huì)釋放出激發(fā)過程中吸收的剩余能量,。
熒光分子在激發(fā)態(tài)駐留的時(shí)間為熒光壽命,，一般為納秒級(jí)別，是熒光分子本身固有的特性,。利用熒光壽命進(jìn)行成像的技術(shù)叫熒光壽命成像(Fluorescence Lifetime Imaging,，F(xiàn)LIM)，可以在熒光強(qiáng)度成像之外,，更加深入地進(jìn)行功能性準(zhǔn)確測(cè)量,，獲取分子構(gòu)象、分子間相互作用,、分子所處微環(huán)境等常規(guī)光學(xué)成像難以獲得的信息,。
熒光的另一個(gè)重要特性是Stokes位移，即激發(fā)峰和發(fā)射峰之間的波長(zhǎng)差異（圖2）,。通常發(fā)射光波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng),。這是由于熒光物質(zhì)被激發(fā)之后、釋放光子之前,，電子經(jīng)過弛豫過程會(huì)損耗一部分能量,。具有較大Stokes位移的熒光物質(zhì)更易于在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
圖2：Stokes位移
熒光顯微鏡是利用熒光特性進(jìn)行觀察、成像的光學(xué)顯微鏡,，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué),、神經(jīng)生物學(xué)、植物學(xué),、微生物學(xué),、病理學(xué)、遺傳學(xué)等各領(lǐng)域,。熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點(diǎn),，非常適合進(jìn)行特定蛋白、細(xì)胞器等在組織及細(xì)胞中的分布的觀察,，共定位和相互作用的研究,，離子濃度變化等生命動(dòng)態(tài)過程的追蹤等等。
細(xì)胞中大部分分子不發(fā)熒光,，想要觀察它們,，必須進(jìn)行熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記的方法非常多,，可以直接標(biāo)記（比如使用DAPI標(biāo)記DNA）,，或利用抗體抗原結(jié)合特性進(jìn)行免疫染色，也可以用熒光蛋白（如GFP,，綠色熒光蛋白）標(biāo)記目標(biāo)蛋白,，還可以用可逆結(jié)合的合成染料（如Fura-2）等。
圖3：Leica DMi8倒置熒光顯微鏡及濾片轉(zhuǎn)輪
目前熒光顯微鏡已成為各個(gè)實(shí)驗(yàn)室及成像平臺(tái)的標(biāo)配成像設(shè)備,，是我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)的好幫手,。熒光顯微鏡主要分為三大類：正置熒光顯微鏡（適合切片）,、倒置熒光顯微鏡（適合活細(xì)胞,，兼顧切片）、熒光體視鏡（適合較大標(biāo)本,，如植物,、斑馬魚（成體/胚胎）、青鳉,、小鼠/大鼠器官等）,。
熒光濾塊是顯微鏡熒光成像的核心部件，由激發(fā)濾片,、發(fā)射濾片和二向分光鏡三部分組成,，安裝在濾片轉(zhuǎn)輪里，如Leica DMi8配有6位濾片轉(zhuǎn)輪（圖3）,。不同的顯微鏡轉(zhuǎn)輪位數(shù)會(huì)有區(qū)別,，也有些顯微鏡使用濾塊滑板。
濾塊在熒光成像中起著重要作用：激發(fā)濾片選擇激發(fā)光來激發(fā)樣品，阻擋其他波長(zhǎng)的光,；通過激發(fā)濾片的光經(jīng)過二向分光鏡（其作用是反射激發(fā)光和透射熒光）,，反射后通過物鏡聚焦，照射到樣品,，激發(fā)出對(duì)應(yīng)的熒光即發(fā)射光,，發(fā)射光被物鏡收集，透過二向分光鏡,，到達(dá)發(fā)射濾片,。如圖4中：激發(fā)波長(zhǎng)為450-490nm，二向分光鏡反射短于510nm的光,、透過長(zhǎng)于510nm的光,，發(fā)射光接收范圍為520-560nm。
圖4：熒光顯微鏡光路圖
熒光顯微鏡常用熒光濾塊可分為長(zhǎng)通（long pass,，簡(jiǎn)稱LP）和帶通（band pass,，簡(jiǎn)稱BP）兩種類型。帶通通常由中心波長(zhǎng)和區(qū)間寬度確定,，如480/40表示可通過460-500nm的光,。長(zhǎng)通濾色片如515 LP，表示可以通過波長(zhǎng)長(zhǎng)于515nm的光（圖5）,。
圖5：FITC光譜曲線及濾片
熒光物質(zhì)具有其特征性激發(fā)（吸收）曲線和發(fā)射曲線,，激發(fā)峰為理想激發(fā)波長(zhǎng)（激發(fā)效率高，從而可以降低激發(fā)光能量,，保護(hù)細(xì)胞和染料）,，發(fā)射曲線為發(fā)射熒光波長(zhǎng)范圍。因此,，在實(shí)驗(yàn)中,，我們會(huì)盡可能選擇與激發(fā)峰接近的波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)，而接收范圍需包括發(fā)射峰,。如Alexa Fluor 488的激發(fā)峰為500nm,，在熒光顯微鏡中可以選擇480/40的激發(fā)濾片。
圖6：Alexa Fluor 488光譜曲線
濾塊的詳細(xì)信息可以在顯微鏡成像軟件里看到,。了解染料并找到匹配樣品的濾塊對(duì)于熒光成像有著至關(guān)重要的作用,。熒光染料和熒光蛋白的光譜信息一般在說明書中會(huì)注明，也可在網(wǎng)上查閱,。
濾塊的選擇除考慮熒光探針的激發(fā),、發(fā)射波長(zhǎng)，對(duì)于多色標(biāo)記樣品還需考慮是否有非特異激發(fā),、是否串色,。此外還需考慮所使用的熒光光源，目前常用的熒光光源有汞燈、金屬鹵素?zé)?，以及近年來飛速發(fā)展的LED光源,。熒光光源的光譜有連續(xù)的和非連續(xù)的，在不同波段能量也會(huì)不同,。LED光源因?yàn)槠湎鄬?duì)較窄的光譜帶,、更穩(wěn)定的能量輸出、超長(zhǎng)的壽命,、更安全環(huán)保等諸多優(yōu)點(diǎn),，正逐步成為熒光顯微鏡的主要光源。
除了顯微鏡內(nèi)置的濾塊,，還有外置快速轉(zhuǎn)輪（圖7）,，徠卡的外置快速轉(zhuǎn)輪相鄰位置濾片轉(zhuǎn)換速度為27ms，可實(shí)現(xiàn)高速多色實(shí)驗(yàn),，如FRET及Fura2比例鈣成像（圖8）等,。
圖7：徠卡外置快速轉(zhuǎn)輪EFW
圖8：鈣成像，F(xiàn)ura2, Cultured hippocampal astrocytes from 18-day-old embryos of Sprague-Dawley rats. Courtesy of: Drs. Kazunori Kanemaru and Masamitsu Iino, Department of Pharmacology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo
為了滿足不同的熒光成像需求,，除熒光顯微鏡外,，還發(fā)展出了各種熒光顯微成像解決方案：
熒光顯微成像技術(shù)應(yīng)用廣泛，種類豐富,，而且新技術(shù)還在不斷涌現(xiàn),，大家可以選擇適合的技術(shù)去完成自己的研究。
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