應(yīng)用專家 易海英
熒光是指熒光物質(zhì)在特定波長光照射下,幾乎同時發(fā)射出波長更長光的過程(圖1),。當(dāng)特定波長(激發(fā)波長)的光照射一個分子(如熒光團(tuán)中的分子)時,,光子能量被該分子的電子吸收。接著,,電子從基態(tài)(S0)躍遷至較高的能級,,即激發(fā)態(tài)(S1’)。這個過程稱為激發(fā)①,。電子在激發(fā)態(tài)停留10-9–10-8秒,,在此過程中電子損失一些能量②。電子離開激發(fā)態(tài)(S1)并回到基態(tài)的過程中③,,會釋放出激發(fā)過程中吸收的剩余能量,。
熒光分子在激發(fā)態(tài)駐留的時間為熒光壽命,一般為納秒級別,,是熒光分子本身固有的特性,。利用熒光壽命進(jìn)行成像的技術(shù)叫熒光壽命成像(Fluorescence Lifetime Imaging,F(xiàn)LIM),,可以在熒光強(qiáng)度成像之外,,更加深入地進(jìn)行功能性準(zhǔn)確測量,獲取分子構(gòu)象,、分子間相互作用,、分子所處微環(huán)境等常規(guī)光學(xué)成像難以獲得的信息。
熒光的另一個重要特性是Stokes位移,,即激發(fā)峰和發(fā)射峰之間的波長差異(圖2),。通常發(fā)射光波長比激發(fā)光波長更長,。這是由于熒光物質(zhì)被激發(fā)之后、釋放光子之前,,電子經(jīng)過弛豫過程會損耗一部分能量,。具有較大Stokes位移的熒光物質(zhì)更易于在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
圖2:Stokes位移
熒光顯微鏡是利用熒光特性進(jìn)行觀察,、成像的光學(xué)顯微鏡,,廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué),、植物學(xué)、微生物學(xué),、病理學(xué),、遺傳學(xué)等各領(lǐng)域。熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點,,非常適合進(jìn)行特定蛋白、細(xì)胞器等在組織及細(xì)胞中的分布的觀察,,共定位和相互作用的研究,離子濃度變化等生命動態(tài)過程的追蹤等等,。
細(xì)胞中大部分分子不發(fā)熒光,,想要觀察它們,,必須進(jìn)行熒光標(biāo)記,。熒光標(biāo)記的方法非常多,可以直接標(biāo)記(比如使用DAPI標(biāo)記DNA),,或利用抗體抗原結(jié)合特性進(jìn)行免疫染色,,也可以用熒光蛋白(如GFP,,綠色熒光蛋白)標(biāo)記目標(biāo)蛋白,,還可以用可逆結(jié)合的合成染料(如Fura-2)等,。
圖3:Leica DMi8倒置熒光顯微鏡及濾片轉(zhuǎn)輪
目前熒光顯微鏡已成為各個實驗室及成像平臺的標(biāo)配成像設(shè)備,,是我們?nèi)粘嶒灥暮脦褪帧晒怙@微鏡主要分為三大類:正置熒光顯微鏡(適合切片),、倒置熒光顯微鏡(適合活細(xì)胞,,兼顧切片),、熒光體視鏡(適合較大標(biāo)本,如植物,、斑馬魚(成體/胚胎)、青鳉,、小鼠/大鼠器官等)。
熒光濾塊是顯微鏡熒光成像的核心部件,,由激發(fā)濾片、發(fā)射濾片和二向分光鏡三部分組成,,安裝在濾片轉(zhuǎn)輪里,如Leica DMi8配有6位濾片轉(zhuǎn)輪(圖3),。不同的顯微鏡轉(zhuǎn)輪位數(shù)會有區(qū)別,,也有些顯微鏡使用濾塊滑板。
濾塊在熒光成像中起著重要作用:激發(fā)濾片選擇激發(fā)光來激發(fā)樣品,,阻擋其他波長的光;通過激發(fā)濾片的光經(jīng)過二向分光鏡(其作用是反射激發(fā)光和透射熒光),,反射后通過物鏡聚焦,,照射到樣品,激發(fā)出對應(yīng)的熒光即發(fā)射光,,發(fā)射光被物鏡收集,,透過二向分光鏡,到達(dá)發(fā)射濾片,。如圖4中:激發(fā)波長為450-490nm,,二向分光鏡反射短于510nm的光、透過長于510nm的光,,發(fā)射光接收范圍為520-560nm。
圖4:熒光顯微鏡光路圖
熒光顯微鏡常用熒光濾塊可分為長通(long pass,,簡稱LP)和帶通(band pass,簡稱BP)兩種類型,。帶通通常由中心波長和區(qū)間寬度確定,,如480/40表示可通過460-500nm的光。長通濾色片如515 LP,,表示可以通過波長長于515nm的光(圖5),。
圖5:FITC光譜曲線及濾片
熒光物質(zhì)具有其特征性激發(fā)(吸收)曲線和發(fā)射曲線,,激發(fā)峰為理想激發(fā)波長(激發(fā)效率高,,從而可以降低激發(fā)光能量,保護(hù)細(xì)胞和染料),,發(fā)射曲線為發(fā)射熒光波長范圍,。因此,在實驗中,,我們會盡可能選擇與激發(fā)峰接近的波長進(jìn)行激發(fā),而接收范圍需包括發(fā)射峰,。如Alexa Fluor 488的激發(fā)峰為500nm,在熒光顯微鏡中可以選擇480/40的激發(fā)濾片,。
圖6:Alexa Fluor 488光譜曲線
濾塊的詳細(xì)信息可以在顯微鏡成像軟件里看到,。了解染料并找到匹配樣品的濾塊對于熒光成像有著至關(guān)重要的作用,。熒光染料和熒光蛋白的光譜信息一般在說明書中會注明,,也可在網(wǎng)上查閱,。
濾塊的選擇除考慮熒光探針的激發(fā),、發(fā)射波長,,對于多色標(biāo)記樣品還需考慮是否有非特異激發(fā)、是否串色,。此外還需考慮所使用的熒光光源,,目前常用的熒光光源有汞燈、金屬鹵素?zé)?,以及近年來飛速發(fā)展的LED光源,。熒光光源的光譜有連續(xù)的和非連續(xù)的,在不同波段能量也會不同,。LED光源因為其相對較窄的光譜帶,、更穩(wěn)定的能量輸出,、超長的壽命、更安全環(huán)保等諸多優(yōu)點,,正逐步成為熒光顯微鏡的主要光源,。
除了顯微鏡內(nèi)置的濾塊,還有外置快速轉(zhuǎn)輪(圖7),,徠卡的外置快速轉(zhuǎn)輪相鄰位置濾片轉(zhuǎn)換速度為27ms,,可實現(xiàn)高速多色實驗,如FRET及Fura2比例鈣成像(圖8)等,。
圖7:徠卡外置快速轉(zhuǎn)輪EFW
圖8:鈣成像,,F(xiàn)ura2, Cultured hippocampal astrocytes from 18-day-old embryos of Sprague-Dawley rats. Courtesy of: Drs. Kazunori Kanemaru and Masamitsu Iino, Department of Pharmacology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo
為了滿足不同的熒光成像需求,除熒光顯微鏡外,,還發(fā)展出了各種熒光顯微成像解決方案:
熒光顯微成像技術(shù)應(yīng)用廣泛,,種類豐富,而且新技術(shù)還在不斷涌現(xiàn),大家可以選擇適合的技術(shù)去完成自己的研究,。
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