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QQ交談MixPlus漩渦振蕩器在檢測樣品是否含有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物
點(diǎn)擊次數(shù)：3404 發(fā)布時間：2012-11-3
艾本森科學(xué)儀器有限公司提供的漩渦振蕩器在對不同的實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)提供了準(zhǔn)確保障！
原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,，繼而按照同Southern Blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測,。
用途：MixPlus漩渦振蕩器在檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量的應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)方法：
[儀器,、試劑,、材料]
（一）儀器
恒溫水浴箱,，電泳儀,，凝膠成像系統(tǒng)，真空轉(zhuǎn)移儀,，真空泵,，UV 交聯(lián)儀，雜交爐,，恒溫?fù)u床,，脫色搖床，MixPlus漩渦振蕩器（合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司）,，分光光度計(jì),，微量移液器，電爐（或微波爐）,，離心管,，燒杯,，量筒，三角瓶,，等,。
（二）材料
總RNA樣品或mRNA樣品,，探針模板DNA（25 ng）,，尼龍膜
（三）試劑
NorthernMax Kit（Cat. # 1940,，Ambion, Inc.）,，瓊脂糖，DEPC, X光底片,，底片暗盒,，Random Primer， dNTP Mixture,，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP,，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，雙氧水, 滅菌水等,。
[方法與步驟]
1. 用具的準(zhǔn)備：
180度烤器皿：三角錐瓶,、量筒、鑷子,、刀片等4小時,。
電泳槽：清洗梳子和電泳槽，并用雙氧水浸泡過夜,，用DEPC水沖洗,，干燥備用。
處理DEPC水（2 L）備用,。
2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染
用RNAZap擦洗梳子,，電泳槽，刀片等,，然后用DEPC水沖洗二次,，去除RNAZap。
3.制膠：
1）. 稱取0.36mg 瓊脂糖加入三角錐瓶中,，加入32.4mlDEPC水后,，微波爐加熱至瓊脂糖*熔解。60℃空氣浴平衡溶液 （需加DEPC水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分）
2）. 在通風(fēng)廚中加入3.6ml的10*Denaturing Gel buffer,，輕輕振蕩混勻,。
注意盡量避免產(chǎn)生氣泡。
3）. 將熔膠倒入制膠板中,，插上梳子
如果膠溶液上存在氣泡,，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除,，或?qū)馀萃频侥z的邊緣。注：膠的厚度不能超過0.5cm,。
4）.膠在室溫下*凝固后,，將膠轉(zhuǎn)移到電泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer蓋過膠面約1cm,，小心拔出梳子,。（配制250ml 1*MOPS Gel Running buffer，在電泳過程中補(bǔ)充蒸發(fā)的buffer,。）
5）.檢查點(diǎn)樣孔。
4. RNA樣品的制備
在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當(dāng)?shù)腅B（終濃度為10ug/ml）,?；靹蚝螅?5℃空氣浴15min,。短暫低速離心后,，立即放置于冰上5min。
5. 電泳：
1）. 將RNA樣品小心加到點(diǎn)樣孔中,。
2）. 在5V/cm下跑膠（5x14cm）,。在電泳過程中，每隔30min短暫停止電泳,，取出膠,，混勻兩極的電泳液后繼續(xù)電泳。當(dāng)膠中的溴紛藍(lán)（500bp）接近膠的邊緣時終止電泳,。
3）. 紫外燈下,，檢驗(yàn)電泳情況，并用尺子測量18S,、28S,、溴紛藍(lán)到點(diǎn)樣孔的距離。
注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時間,。
6. 轉(zhuǎn)膜
1）.用3%雙氧水浸泡真空轉(zhuǎn)移儀后,，用DEPC水沖洗。
2）.用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏,，用DEPC水沖洗二次,。
3）.連接真空泵和真空轉(zhuǎn)移儀，剪取一塊適當(dāng)大小的膜（膜的四邊緣應(yīng)大于塑膠屏孔口的5mm）,，膜在Transfer buffer浸濕5分鐘后,，放置在多孔滲水屏的適當(dāng)位置。
4）.蓋上塑膠屏,，蓋上外框,，扣上鎖,。
5）.將膠的多余部分切除，切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔,，并至少蓋過邊緣約2mm,，以防止漏氣。
6）.將膠小心放置在膜的上面,，膜與膠之間不能有氣泡,。
7）.打開真空泵，使壓強(qiáng)維持在50~58mbar;立即將transfer buffer加到膠面和四周,。每隔10min在膠面加上1ml transfer buffer,，真空轉(zhuǎn)移2小時。
8）.轉(zhuǎn)膜后,，用鑷子夾住膜,，于1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒，去除殘余的膠和鹽,。
9）.用吸水紙吸取膜上多余的液體后,，將膜置于UV交聯(lián)儀中自動交聯(lián)。
10）.將膠和紫外交聯(lián)后的膜,，在紫外燈下檢測轉(zhuǎn)移效率,。（避免太長的紫外曝光時間）
11）.將膜在-20℃保存。
7. 探針的制備
1）.在1.5ml離心管中配制以下反應(yīng)液：
模板DNA（25 ng） 1ul
Random Primer 2ul
滅菌水 11ul
總體積：14ul
2）.95°C加熱3分鐘后,，迅速放置于冰冷卻5min,。
3）.在離心管中按下列順序加入以下溶液：
10×Buffer 2.5ul
dNTP Mixture 2.5ul
111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul
Exo-free Klenow Fragment 1 ul
4）.混勻后（25ul），37°C下反應(yīng)30分鐘,。短暫離心,，收集溶液到管底。
5）.65°C加熱5min使酶失活,。
8. 探針的純化及比活性測定：
1）.準(zhǔn)備凝膠：將1g凝膠加入30ml的DEPC水中,，浸泡過夜。用DEPC水洗滌膨脹的凝膠數(shù)次,，以除去可溶解的葡聚糖,。換用新配制的TE（PH7.6）。
2）.取1ml一次性注射器,，去除內(nèi)芯推捍,，將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住，在注射器中裝填Sephadex G-50凝膠,。
3）.將注射器放入一支15ml離心管中,，注射器把手架在離心管口上。1600g離心4分鐘,，凝膠壓緊后,，補(bǔ)加Sephadex G-50凝膠懸液,，重復(fù)此步直至凝膠柱高度達(dá)注射器0.9ml刻度處
4）.100ul STE緩沖液洗柱，1600g離心4min,。重復(fù)3次,。
5）.倒掉離心管中的溶液后，將一去蓋的1.5ml離心管置于管中,，再將裝填了Sephadex G-50凝膠的注射器插入離心管中,，注射器口對準(zhǔn)1.5ml離心管。
6）.將標(biāo)記的DNA樣品加入25 ul STE,，取出0.5ul點(diǎn)樣于DE8 paper上,，其余上樣于層析柱上。
7）.1600g離心4min,，DNA將流出被收集在去蓋的離心管中,，而未摻入DNA的dNTP則保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點(diǎn)樣于DE8-paper.
8）. 測比活性（試劑比活要求:106cpm/ml）,。
9.預(yù)雜交：
1）.將預(yù)雜交液在雜交爐中68℃預(yù)熱，并漩渦使未溶解的物質(zhì)溶解,。
2）.加入適當(dāng)?shù)腢LRAhyb到雜交管中（以100cm2 膜面積加入10mlULRAhyb雜交液）,，42℃預(yù)雜交4 hr。
10.探針變性：
1）.用10 mM EDTA將探針稀釋10倍,。
2）.90℃熱處理稀釋后探針10min后,，立即放置于冰上5min。
3）.短暫離心,，將溶液收集到管底,。
11.雜交：
1）.加入0.5ml ULTRAhyb到變性的探針中，混勻后,，將探針加到預(yù)雜交液中,。
2）.42℃雜交過夜（14~24hr）。
雜交完后,，將雜交液收集起來于-20℃保存,。
12.洗膜：
1）.低嚴(yán)緊性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 （100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液），室溫下,，搖動洗膜5min兩次,。
2）.高嚴(yán)緊性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 （100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液），42℃ 搖動洗膜20min兩次,。
13.曝光：
1）. 將膜從洗膜液中取出,，用保鮮膜包住，以防止膜干燥,。
2）. 檢查膜上放射性強(qiáng)度,，估計(jì)曝光時間
3）. 將X光底片覆蓋與膜上,，曝光
4）. 沖洗X光底片，掃描記錄結(jié)果,。
14.去除膜上的探針：將200ml 0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后,，將膜放入，室溫下讓SDS冷卻到室溫,，取出膜,，去除多余的液體，干燥后,，可以保存幾個月,。
15.雜交結(jié)果
操作應(yīng)該小心，但不必緊張,。用于RNA電泳,、轉(zhuǎn)膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse 酶,，以免樣品的降解,。轉(zhuǎn)膜時，注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡