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人血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （VCAM-1）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定人血清,，血漿及相關(guān)
液體樣本中血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （VCAM-1）的含量,。
實驗原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （VCAM-1）水平,。用純
化的人血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （VCAM-1）抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的
微孔中依次加入血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （VCAM-1）,，再與HRP 標記的血管內(nèi)皮細胞粘附分
子1 （VCAM-1）抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB 顯
色,。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺
和樣品中的血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （VCAM-1）呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm 波長下測定吸
光度（OD 值）,，通過標準曲線計算樣品中人血管內(nèi)皮細胞粘附分子1 （VCAM-1）濃度。
試劑盒組成：
試劑盒組成48 孔配置96 孔配置保存
說明書1 份1 份
封板膜2 片（48） 2 片（96）
密封袋1 個1 個
酶標包被板1×48 1×96 2-8℃保存
標準品：540μg/L 0.5ml×1 瓶0.5ml×1 瓶2-8℃保存
標準品稀釋液1.5ml×1 瓶1.5ml×1 瓶2-8℃保存
酶標試劑3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
樣品稀釋液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
顯色劑A 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
顯色劑B 液3 ml×1 瓶6 ml×1 瓶2-8℃保存
終止液3ml×1 瓶6ml×1 瓶2-8℃保存
濃縮洗滌液（20ml×20 倍）×1 瓶（20ml×30 倍）×1 瓶2-8℃保存
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20 分鐘,，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上
清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心,。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20 分鐘后,，離心
20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次
離心,。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,，保存過程
中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集,。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/
2
分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液,，細胞
濃度達到100 萬/ml 左右。通過反復(fù)凍融,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份,。離心20 分
鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。
5. 組織標本：切割標本后,，稱取重量,。加入一定量的PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用,。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器
將標本勻漿充分,。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。分裝后一份待
檢測,，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上
進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。
操作步驟
1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10 孔,，在*、第二孔中分別加標
準品100μl,，然后在*,、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻,；然后從*孔,、第二
孔中各取100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三,、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,，
混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 棄掉，再各取50μl 分別加到第五,、第六孔
中,，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,，混勻,；混勻后從第五、第六孔中各
取50μl 分別加到第七,、第八孔中,，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,，混
勻后從第七、第八孔中分別取50μl 加到第九,、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標準
品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl 棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，
濃度分別為360μg/L，240μg/L ,，120μg/L,，60μg/L， 30μg/L）,。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）、待測樣
品孔,。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣
品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混
勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘,。
4. 配液：將30（48T 的20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T 的20 倍）倍稀釋后備用,。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去,，如此
重復(fù)5 次,，拍干,。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外,。
7. 溫育：操作同3,。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）,。測定應(yīng)在加終止
液后15 分鐘以內(nèi)進行,。
注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
2． 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果,。
3． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性,，以避免試驗誤差,。一次加樣時間
控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔,。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值
大于標準品孔*孔的OD 值）,，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計
3
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
5． 封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。
6． 底物請避光保存,。
7． 嚴格按照說明書的操作進行,，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
9． 本試劑不同批號組分不得混用,。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準,。
計算：
以標準物的濃度為橫坐標,，OD 值為縱坐標,，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD
值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋
倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD 值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值
代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋
倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值為0.990 以上,。
2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和11%
檢測范圍：
20μg/L -400μg/L
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：；2-8℃,。
2．有效期：6 個月