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一、人工純化
人工純化,，即利用人為手段造成某一細(xì)胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長從而達(dá)到純化細(xì)胞的目的,。

1,、酶消化法
酶消化法是比較常用的純化方法，不僅對貼壁細(xì)胞可行,，能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受性不同,，使兩者分開，達(dá)到純化的目的,，對貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的,。
(1)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化
兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細(xì)胞先脫壁,，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長的時(shí)間才脫壁,，特別是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開,，方法如下：
①采用常規(guī)消化傳代方式 將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內(nèi)兩次,，每次加1mL(25mL培養(yǎng)瓶)來回輕搖1-2次，使胰蛋白酶流過所有細(xì)胞表面,，然后倒掉,。
②蓋好瓶塞(或蓋)，將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察,，發(fā)現(xiàn)纖維樣細(xì)胞變圓,，部分脫落，立即加入2mL有血清的培養(yǎng)液終止消化,。
③用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細(xì)胞生長的區(qū)域(可事先在鏡下用記號筆在培養(yǎng)瓶上劃出記號),。吹打時(shí)不要用力，也不要吹打上皮細(xì)胞生長區(qū)域,。吹打結(jié)束后,，再用少量培養(yǎng)液漂洗一遍，然后加入適量培養(yǎng)液于瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng),，也可重復(fù)上述操作再進(jìn)行一次,，隔幾日后或下次傳代時(shí)，再進(jìn)行上述操作,，經(jīng)過幾次處理,，就可將成纖維細(xì)胞去除或?qū)烧叻珠_,。
(2)骨髓基質(zhì)肌樣細(xì)胞的純化
在血液細(xì)胞和骨髓細(xì)胞靜置培養(yǎng)時(shí)，常有許多肌樣細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長,，但也有許多淋巴細(xì)胞,、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞粘附其上,，種類混雜,，鑒于粘附細(xì)胞貼壁不牢固，也可用酶消化法使粘附細(xì)胞脫壁分離,，以達(dá)到骨髓基質(zhì)細(xì)胞或血液中肌樣細(xì)胞與淋巴細(xì)胞分開和純化的目的,。其方法如下：
①待基質(zhì)或肌樣細(xì)胞基本形成單層時(shí)，倒去舊液,，加入無鈣,、鎂PBS漂洗，并用力搖動(dòng)后倒掉,，反復(fù)洗2~3次后,，一方面可洗去血清和鈣鎂離子以助酶消化，另一方面又可使大部分粘附細(xì)胞被洗掉,，但仍留有不少粘附細(xì)胞,。
②將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶1mL(25mL培養(yǎng)瓶),，輕輕搖動(dòng)讓胰蛋白酶流過細(xì)胞表面,，作用1~2分鐘后再輕輕搖動(dòng)1~2次后倒去。
③蓋好瓶蓋,，在普通顯微鏡下觀察,，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)或肌樣細(xì)胞由于貼壁較牢固未脫壁，而原先粘附的細(xì)胞已浮起,，此時(shí)再加2mL PBS洗一次倒掉,，盡量除去粘附細(xì)胞。
④加入含血清的培養(yǎng)基終止消化,，再繼續(xù)用力搖動(dòng)后倒掉,，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。隔幾日或下次傳代前,，再進(jìn)行上述操作,，經(jīng)過幾次處理和傳代培養(yǎng)后就可將粘附細(xì)胞去除，將兩者分開,，達(dá)到使骨髓基質(zhì)細(xì)胞或肌樣細(xì)胞純化的目的,。
2、細(xì)胞因子依賴純化法
人和動(dòng)物組織中某些細(xì)胞需要有特殊的細(xì)胞因子存在的微環(huán)境才能長期存活和生長繁殖,，如IL-2是T細(xì)胞生長所必需的細(xì)胞因子,，BCGF是B細(xì)胞的生長因子,，體外培養(yǎng)中淋巴細(xì)胞若加入IL-2就可使T細(xì)胞生長繁殖，形成IL-2依賴的T細(xì)胞系,，如CTLL-2細(xì)胞株,，而其他細(xì)胞則自然被淘汰，采用此法還建立了IL-6依賴的細(xì)胞系,，如B9,、CTD7細(xì)胞株。
3,、機(jī)械刮除法
原代培養(yǎng)時(shí),如果上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為分區(qū)成片混雜生長,，每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上?？刹捎脵C(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域而保留需要的細(xì)胞區(qū)域，其方法如下：
(1)將要純化細(xì)胞的培養(yǎng)瓶,，在凈化室內(nèi)放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進(jìn)行,。
(2)用硅橡皮刮子在不需要生長的細(xì)胞區(qū)域推劃，使細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中,，注意不要傷及所需細(xì)胞,。
(3)推劃后用培養(yǎng)液沖洗振搖兩次倒掉，即可將培養(yǎng)基加入原瓶繼續(xù)培養(yǎng),。
(4)數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細(xì)胞又長出,，可再進(jìn)行上述操作，這樣反復(fù)多次可以純化細(xì)胞,。操作過程中要嚴(yán)格無菌操作,，防止污染。
4,、電烙篩選法
在貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí),，往往在培養(yǎng)瓶的細(xì)胞層中會出現(xiàn)分散的轉(zhuǎn)化灶，轉(zhuǎn)化灶區(qū)域細(xì)胞密集,、排列規(guī)則,，有明顯生長趨勢，與周邊未能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有明顯的區(qū)域界限,，此時(shí)即可用機(jī)械刮除法去除未轉(zhuǎn)化細(xì)胞,，也可用電烙篩選法燙死未轉(zhuǎn)化細(xì)胞而保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞。其方法如下：
(1)倒去舊液,，并用記號筆劃出轉(zhuǎn)化灶的區(qū)域,。
(2)用加熱的微型電烙器(類似焊接用的電烙鐵)將轉(zhuǎn)化灶周邊的細(xì)胞全部燙死，只保留轉(zhuǎn)化灶細(xì)胞,。在單細(xì)胞克隆篩選時(shí),，也可用此法將單個(gè)細(xì)胞周圍的細(xì)胞殺死,，然后在適應(yīng)性培養(yǎng)基中(50%是舊液)繼續(xù)培養(yǎng)，即可達(dá)到純化的目的,。
5,、反復(fù)貼壁法
成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，其貼壁過程快,，大部分細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi)(大約10~30min)完成附著過程(但不一定*伸展),，而上皮細(xì)胞(大部分)在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起,，利用此差別可以純化細(xì)胞,。其方法如下：
(1)將細(xì)胞懸液接種在一個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)(培養(yǎng)液內(nèi)不含血清，此時(shí)上皮細(xì)胞貼壁更慢)靜置20分鐘,。
(2)在倒置顯微鏡下觀察,，見部分細(xì)胞貼壁，稍加搖動(dòng)也不浮起時(shí),，將細(xì)胞懸液倒入另一培養(yǎng)瓶中,，繼續(xù)靜置培養(yǎng)20min，然后再重復(fù)上述操作后,，即可將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分隔開,，在第1瓶和第2瓶以成纖維細(xì)胞為主，往后幾瓶即以上皮細(xì)胞為主,，下次傳代時(shí)再按上述方法處理,，就可使兩者達(dá)到*分開的目的。

二,、 自然純化
自然純化即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢,，在長期傳代過程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長慢的細(xì)胞,，靠自然增殖的潛力,，zui后留下生長優(yōu)勢旺的細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化的目的,。但這種方法常無法按照需要和實(shí)驗(yàn)要求及目的來選擇細(xì)胞,，此法花費(fèi)時(shí)間長，留下來的往往是成纖維細(xì)胞,。僅有那些惡性變的腫瘤細(xì)胞或突變的細(xì)胞可以通過此方法而保留下來,，不斷純化而建立細(xì)胞系。