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細(xì)胞計數(shù)及活力測定
點擊次數(shù)：4735 發(fā)布時間：2010-9-6
細(xì)胞計數(shù)及活力測定
一,、原理
培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好,，所以要進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),。計數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示,。細(xì)胞計數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計數(shù)相同,。
在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞,，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力,，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用,。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力,，了解凍存和復(fù)蘇的效果。
用臺盼蘭染細(xì)胞,，死細(xì)胞著色,，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞,。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng),，也可測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力。
二,、儀器,、用品與試劑
1、儀器與用品：普通顯微鏡,、血球計數(shù)板,、試管、吸管,、酶標(biāo)儀（或分光光度計）
2,、試劑：0.4％臺盼蘭，0.5％四甲基偶氮唑鹽（MTT）,、酸化異丙醇
3,、材料：細(xì)胞懸液
三、操作步驟
（一）細(xì)胞計數(shù)
1,、將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈,，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。
2,、將細(xì)胞懸液吸出少許,，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間,。
3,、靜置3分鐘。
4,、鏡下觀察,，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計左側(cè)和上方的。然后按下式計算：
細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000
注意：鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),，應(yīng)按單個細(xì)胞計算,，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好,，需重新制備細(xì)胞懸液,。
（二）細(xì)胞活力
1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中,。
2,、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘,。
3,、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片,。
4,、鏡下取幾個任意視野分別計死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計細(xì)胞活力,。
死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色,，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色,，鏡下呈無色透明狀,。
活力測定可以和細(xì)胞計數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用,。
（三）MTT法測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力
活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍,。其量與細(xì)胞數(shù)呈正比，也與細(xì)胞活力呈正比,。
l,、細(xì)胞懸液以1000rpm離心10分鐘，棄上清液,。
2,、沉淀加入0.5－1ml MTT,，吹打成懸液,。
3、37℃下保溫2小時,。
4,、加入4—5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻,。
5,、1000 rpm離心，取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計570nm比色,，酸化異丙醇調(diào)零點,。
注意：MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力,，不能測定細(xì)胞數(shù)。
附：1,、0.4%臺盼蘭染液配制：
臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml,。
2、MTT配制：
MTT 0.5克,，溶于100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎(chǔ)液中,。4℃下保存。
3,、酸化異丙醇配制：
異丙醇中加入HCl使zui終達(dá)0.04mol/L,。