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技術(shù)文章
如何選購(gòu)流式抗體？
點(diǎn)擊次數(shù)：1685 發(fā)布時(shí)間：2015-10-22
由于在流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程中,，熒光抗體對(duì)單細(xì)胞懸液的標(biāo)記效果直接影響實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)質(zhì)量,。因此，需要考慮各種影響流式抗體品質(zhì)及檢測(cè)效果的因素,，例如抗體特異性,、熒光素信號(hào)強(qiáng)弱、熒光素標(biāo)記方式,、同型對(duì)照等,。
流式抗體的選擇：
1. 流式抗體本身也是抗體，所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇zui基本的條件：目標(biāo)蛋白特異性,，反應(yīng)種屬以及應(yīng)用實(shí)驗(yàn),。
2. 流式抗體熒光標(biāo)記的方式包括直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。在流式實(shí)驗(yàn)過程中,，盡量減少實(shí)驗(yàn)工序和過程,，以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)和準(zhǔn)確性。因此在條件允許的范圍內(nèi),，建議盡量用直接標(biāo)記的抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)而不去做間接標(biāo)記,。
3. 流式抗體熒光標(biāo)記的選擇：如果實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)單一指標(biāo)：不同熒光標(biāo)記在不同的儀器上強(qiáng)度不同。FACS Calibur儀器為例：PE >APC >PE-Cy5 >PerCP >FITC >PerCP-Cy5.5,，通常來說,，PEzui強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原,。FITC強(qiáng)度較弱,，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原,，使用范圍比較廣。用戶需根據(jù)檢測(cè)的目標(biāo)蛋白進(jìn)行具體選擇,。如果同時(shí)檢測(cè)多個(gè)指標(biāo)：確認(rèn)流式細(xì)胞儀能檢測(cè)多少個(gè)通道：流式抗體每個(gè)通道只能選擇1種熒光素,。各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配。如：實(shí)驗(yàn)者同時(shí)檢測(cè)三個(gè)指標(biāo),，可以在圖1中綠色、黃色和紅色三個(gè)通道中各選一個(gè)適當(dāng)?shù)臒晒馑貥?biāo)記,，F(xiàn)ITC,、PE和PE-cy5。切忌所有指標(biāo)選擇同一個(gè)通道的熒光標(biāo)記,，以防止熒光的重疊和相互干擾,，影響zui后結(jié)果。因此,，流式細(xì)胞儀的通道越多,，同一份樣本能同時(shí)做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多。常用熒光標(biāo)記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等,。
同型對(duì)照的選擇：
流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和其他抗體相關(guān)實(shí)驗(yàn)有點(diǎn)不同的就是需要選擇同型對(duì)照,。同型對(duì)照，是用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細(xì)胞表面而產(chǎn)生的背景染色,，相當(dāng)于實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照,。同型對(duì)照選擇與標(biāo)記抗體同種屬來源，同亞型,，同熒光標(biāo)記的抗體,。比如：抗人的CD3的PE標(biāo)記的抗體，小鼠的IgG2a,。同型對(duì)照選擇PE標(biāo)記的小鼠的IgG2a,。
流式抗體使用注意事項(xiàng)：
1建議實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的數(shù)量和抗體的比例要適當(dāng)。細(xì)胞過量或抗體過量都可能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果受影響,，因此需要優(yōu)化試驗(yàn)條件,。注：不同的流式技術(shù)對(duì)抗體的需求量有較大差異，例如傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)(采用鞘液流系統(tǒng))需要1×106個(gè)細(xì)胞為起始上樣量,，抗體用量為10μl,，而微流式細(xì)胞術(shù)則只需5×105個(gè)細(xì)胞，抗體用量減少到5μl,。
2 直標(biāo)的流式抗體應(yīng)該4℃避光保存,，不要冷凍。
3 盡量選擇經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的流式抗體,，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。