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                                                             細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)解答

一,、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)問(wèn)答

1.BHK細(xì)胞就是指BHK21嗎,？

    答：BHK細(xì)胞是指幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞（Baby Hamster Syrian Kidney），1961年建株,。原始的細(xì)胞株是成纖維細(xì)胞,，貼壁依賴性。1963年獲得單細(xì)胞克隆細(xì)胞,。后經(jīng)無(wú)數(shù)次傳代后細(xì)胞可懸浮生長(zhǎng),，它廣泛用于增殖各種病毒，生產(chǎn)獸用疫苗,。zui常用的是BHK21的一個(gè)亞克隆細(xì)胞,，即克隆13或C13 。

2.二倍體細(xì)胞有什么特點(diǎn),？

   答：二倍體細(xì)胞的染色體組型是2n核型,；貼壁依賴接觸抑制；一般可傳代50代,；無(wú)致瘤性,。如W1-38：正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系,。

3.什么是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng),？

    答：所謂動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)（large-scale culture technology）是指在人工條件下（設(shè)定pH、溫度、溶氧等）,，在細(xì)胞生物反應(yīng)器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù),。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞有雞胚、豬腎,、猴腎,、地鼠腎等多種原代細(xì)胞及人二倍體細(xì)胞、CHO（中華倉(cāng)鼠卵巢）細(xì)胞,、BHK-21,、Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎傳代細(xì)胞）等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗,、口蹄疫疫苗,、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗,、紅細(xì)胞生成素,、單克隆抗體等產(chǎn)品。

    在過(guò)去幾十年來(lái),，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)有了很大發(fā)展,，從使用轉(zhuǎn)瓶（roller bottle） 、CellCube等貼壁細(xì)胞培養(yǎng),，發(fā)展為生物反應(yīng)器（Bioreactor）進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng),。

4.細(xì)胞體內(nèi)外培養(yǎng)的差別是什么？

    答：細(xì)胞離體后,，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響,，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡相對(duì)穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長(zhǎng),，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱,；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性,，變成可無(wú)限生長(zhǎng)的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系,。因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體,，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能,，也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實(shí)際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后,，這種差異就開(kāi)始發(fā)生了,。

5.什么是無(wú)血清培養(yǎng)基？與普通培養(yǎng)基有什么區(qū)別,？

    答：無(wú)血清培養(yǎng)基（serum free medium,SFM）:是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基,。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分,。基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分,。添加組分可能包括纖連蛋白,、層粘連蛋白等貼壁因子、胰島素,、轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒等,。

6.什么是無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基,、無(wú)蛋白培養(yǎng)基和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基？

    答：無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基是不含任何動(dòng)物來(lái)源成份的無(wú)血清培養(yǎng)基,，但可能添加植物蛋白或重組蛋白,。無(wú)蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）:即不含有蛋白的培養(yǎng)基,，無(wú)論是植物蛋白或動(dòng)物蛋白。成分培養(yǎng)基（chemical defined medium,CDM）:是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的,，它同樣不含有蛋白,，也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物,，如短肽等,。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物和產(chǎn)品純化。

7.HEPES在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中起什么作用,？

    答：HEPES溶液：是一種弱酸,，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動(dòng),。在開(kāi)放式培養(yǎng)條件下,，觀察細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出,，pH迅速升高,，若加了HEPES，此時(shí)可以維持pH7.0左右,。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時(shí)要添加HEPES,。

8.CO2 培養(yǎng)箱之水盤(pán)如何保持清潔？

答：定期（至少每?jī)芍芤淮危?以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之,。

二、 培養(yǎng)基生產(chǎn)和使用常見(jiàn)問(wèn)題

1.低血清培養(yǎng)基能用肉眼判斷其pH值嗎,？

   答：低血清培養(yǎng)基中酚紅的含量與普通培養(yǎng)基中的酚紅含量不同,，不能通過(guò)肉眼觀察或通過(guò)經(jīng)驗(yàn)來(lái)判定pH值,，建議使用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

2.低血清培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)是什么,？

   答：平衡鹽一般是由無(wú)機(jī)鹽及葡萄糖組成的,。平衡鹽有Hanks′系統(tǒng)、Earle′s系統(tǒng),、Dulbecco′s磷酸緩沖鹽系統(tǒng)等,。199系列培養(yǎng)基、MEM系列培養(yǎng)基均有Hanks′系統(tǒng)的培養(yǎng)基及Earle′s系統(tǒng)的培養(yǎng)基,。但是有些培養(yǎng)基均不是以上常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng),，例如RPMI 1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基,。MEM（SLM）低血清培養(yǎng)基的平衡鹽系統(tǒng)也不是常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng),，該平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力強(qiáng)于常規(guī)平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力。

3.谷氨酰胺溶液和碳酸氫鈉的配制方法是什么,？

   答：以0.2mol/L的 L-谷氨酰胺配制為例：稱取L-谷氨酰胺2.92g,，加注射用水100ml，充分?jǐn)嚢杌靹?。?.2μm濾膜正壓過(guò)濾除菌,。溶液應(yīng)在4℃下避光保存，2周內(nèi)使用,。以7.5% NaHCO3的配制為例：稱取NaHCO37.5g溶于100ml蒸餾水中過(guò)濾除菌,。

4.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

   答：酚紅在培養(yǎng)基中用作pH值的指示劑：中性時(shí)為紅色,，酸性時(shí)為黃色,，堿性時(shí)為紫色。酚紅本身對(duì)生物制品質(zhì)量并不會(huì)產(chǎn)生影響,，可以通過(guò)純化技術(shù)去除,，但酚紅在無(wú)血清培養(yǎng)基可能帶來(lái)胞內(nèi)鈉/鉀失衡，影響細(xì)胞生長(zhǎng),，當(dāng)然這種作用能被血清所中和或減輕,。酚紅并不是培養(yǎng)基中必需的一種成分，很多國(guó)外的疫苗或抗體生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中都使用無(wú)酚紅培養(yǎng)基,。

5.放置在冰箱中的培養(yǎng)基顏色會(huì)發(fā)生變化,，為什么？

     答：培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中,，培養(yǎng)基內(nèi)CO2 會(huì)逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性。而培養(yǎng)基中酸堿指示劑（通常為phenol red）的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅,。培養(yǎng)基偏堿后再用于細(xì)胞培養(yǎng)將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡,。培養(yǎng)基偏堿時(shí),，可以通入無(wú)菌過(guò)濾的CO2，以調(diào)整pH值,。

6.無(wú)血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎,？

    答：當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%,。因?yàn)檠逯械牡鞍讜?huì)結(jié)合和滅活一些抗生素,。而在無(wú)血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活,。

7.培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后,，可長(zhǎng)期保存嗎？

    答：一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí),，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解,。

8.什么是個(gè)性化培養(yǎng)基,？它有什么優(yōu)點(diǎn)？

    答：根據(jù)細(xì)胞類型,、培養(yǎng)方式和生產(chǎn)工藝等特點(diǎn)所定制的培養(yǎng)基,，即個(gè)性化培養(yǎng)基。個(gè)性化培養(yǎng)基在國(guó)外生物制藥企業(yè)被普遍采用,，個(gè)性化培養(yǎng)基可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),，能提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速率、培養(yǎng)密度,、以及延長(zhǎng)細(xì)胞維持時(shí)間,；也可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供均衡的營(yíng)養(yǎng)供給，減少細(xì)胞有害代謝物質(zhì)的積累,，降低對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的危害,；同時(shí)對(duì)貼壁細(xì)胞而言，能增加細(xì)胞的貼壁性,，并降低培養(yǎng)過(guò)程中剪切力對(duì)細(xì)胞的損傷,；個(gè)性化培養(yǎng)基可以根據(jù)各戶的特殊需求減少或不使用動(dòng)物源成分，從而使生物制品安全性更有保障,。

9.細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍,，可否繼續(xù)使用？

    答：如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍,，您應(yīng)該自然溶解培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生,。如果沒(méi)有沉淀產(chǎn)生,，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀,，只能丟棄這些培養(yǎng)基,。

10.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

    答：動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10%DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95%原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合,。注意：由于DMSO稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成,。

11.培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎,？

    答：大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次，如果次數(shù)過(guò)多會(huì)將使含有的蛋發(fā)生降解和沉淀,，這將會(huì)影響它的性能。

12.液體培養(yǎng)基的保存是冷藏好？還是冷凍好,？

    答：要冷藏?。⊥ǔＲ后w培養(yǎng)基在冷藏條件下可存放6個(gè)月到一年,。

三,、常見(jiàn)血清使用問(wèn)題
1.血清使用時(shí)一定需要滅活么？

答：實(shí)驗(yàn)顯示,，經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的,。經(jīng)此處理過(guò)的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn),，或*沒(méi)有任何作用，甚至因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量,，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低,。而經(jīng)過(guò)熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多,，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,，像是“小黑點(diǎn)”，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染,，而把血清放在37℃環(huán)境中,，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增,。若非必須,，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時(shí)間,，更確保血清的質(zhì)量,。

2.何謂FBS, FCS, CS, HS?

答：FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清,， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼， 請(qǐng)不要再使用,。CS （calf serum） 則是指小牛血清,。HS （horseserum） 則是指馬血清。

3.保存血清的方法是什么?

答：我們建議血清應(yīng)保存在-5℃至-2O℃,。若存放于4℃時(shí),，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。若一次無(wú)法用完一瓶,，建議無(wú)菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi),，再放回冷凍。

4.如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?

答：將血清從冷凍箱取出后,，先置于2～8℃冰箱使之融解,，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,，融解過(guò)程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻,。

5.血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?

    答：血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因,，但zui普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中,，亦是造成沉淀物的原因之一,。但這些絮狀沉淀物,，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物,，可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內(nèi),，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾。不使用過(guò)濾的方法去除這些絮狀沉淀物,，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞過(guò)濾膜,。

6.如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生?

    答: （1）解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法（-20℃至4℃至室溫）,，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大（如-20℃至37℃）,，非常容易產(chǎn)生沉淀物。

        （2）解凍血清時(shí),，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻,，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生,。

        （3）請(qǐng)勿將血清置于37℃太久,。若在37℃放置太久，血清會(huì)變得混濁,，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分會(huì)因此受到損害,，而影響血清的質(zhì)量。

        （4）血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,，若非必要,，可以無(wú)須做此步驟。

        （5）若必須做血清的熱滅活,，請(qǐng)遵守56℃,，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻,。溫度過(guò)高,，時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多,。

四,、細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑使用問(wèn)答

1.谷氨酰胺使用方法是什么？

    答：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,，故4℃下放置1周可分解50%,，使用中單獨(dú)配制，置-20℃冰箱中保存,，用前加入培養(yǎng)液中,。

2.碳酸氫鈉在室溫條件存放是否穩(wěn)定？

答：碳酸氫鈉白色粉末，或不透明單斜晶系細(xì)微結(jié)晶,。比重2.159,。無(wú)臭、味咸,，可溶于水,，微溶于乙醇。其水溶液因水解而呈微堿性,，受熱易分解,，在65℃以上迅速分解，在270℃時(shí)*失去二氧化碳,，在干燥空氣中無(wú)變化,，在潮濕空氣中緩慢分解。

3.培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢的原因有哪些,？其解決辦法有哪些,？

    答：可能得原因有：更換了不同的培養(yǎng)液或血清；培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子等耗盡或缺乏或已被破壞,；培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染,；試劑保存不當(dāng)；比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分,，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)找出可能的原因,。

        解決辦法：增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度；讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液,；換入新鮮配制培養(yǎng)液,；補(bǔ)加谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子等；用無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng),，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物,，或用抗生素除菌,；血清需保存在-5℃到-20℃；培養(yǎng)液需在2－8℃避光保存,；含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存,，并在2 周內(nèi)用完；分離培養(yǎng)物,，檢測(cè)支原體,。

4.L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎,？

    答：L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)非常重要的,。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝,。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解,，降解率隨保存溫度而變。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性,。

5.細(xì)胞傳代消化時(shí)所用胰酶濃度越高越好嗎？

    答：不見(jiàn)得,！因?yàn)橐鹊鞍酌溉芤旱南芰κ呛腿芤旱膒H,、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關(guān),。通常情況下,，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力zui強(qiáng)。另外,，鈣,、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進(jìn)行傳代消化前,，一定要用D-Hanks液或PBS液反復(fù)沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶,，以便于將含血清的培養(yǎng)基沖洗干凈，這樣就能大大提高消化液的消化能力,。通常使用的消化液濃度為：

     （1）0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA,；

     （2）0.25% 胰蛋白酶

     多數(shù)細(xì)胞傳代消化可使用0.25％胰蛋白酶＋0.02％EDTA這種消化液。

6.二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎,？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么,？

    答：二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子,，以便保持抑制胰蛋白酶的活性,。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞,，以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子,。

7.GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I,？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定,？

    答：GlutaMAX-I 即谷丙氨酸二肽，是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物,，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù),。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用,。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,，即使在121磅滅菌20分鐘,，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下,，L-谷氨酰胺幾乎*降解

8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么,？

    答：丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,，但是,，如果沒(méi)有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉,。

9.Hank′s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle′s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別,？

    答：HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagle′s （2.2g/L）中比在Hanks′ （0.35g/L） 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,，以維持溶液的PH值,。Eagle′s液在空氣水平的CO2 中，溶液會(huì)變堿,，Hanks′液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸,。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagle′s液,。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織,，用Hanks′液就可以了。

五,、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程常見(jiàn)問(wèn)題

1.為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時(shí)傳代,？

    答：體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長(zhǎng)接觸抑制的特性，也就是說(shuō)當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候,，它就會(huì)停止生長(zhǎng),，及時(shí)傳代后，細(xì)胞的生長(zhǎng)得以繼續(xù),。

2.培養(yǎng)液pH下降很快可能原因有哪些,？其解決辦法是什么？

    答：通常細(xì)胞生長(zhǎng)得非?？鞎r(shí),，pH值通常下降得很快。此時(shí)可以及時(shí)傳代,、提高傳代比例或降低血清量等方法進(jìn)行解決。此外,，培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊,、NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖能力不夠、培養(yǎng)液中鹽濃度不正確,、細(xì)菌,、酵母或真菌污染等也能導(dǎo)致pH值通常下降得很快。

       （1）按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3對(duì)應(yīng)CO2濃度為5％到10％,。

       （2）改用不依賴CO2培養(yǎng)液,。

       （3）松開(kāi)瓶蓋1/4 圈。加HEPES 緩沖液至10 到25mM終濃度,。

       （4）在CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液,，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。

       （5）如果是污染造成的則丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌,。

3.培養(yǎng)液pH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,？

    答：由于大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)將產(chǎn)生有害的影響,。但各種細(xì)胞對(duì)pH的要求也不*相同,，原代培養(yǎng)細(xì)胞一般對(duì)pH變動(dòng)耐受差，無(wú)限細(xì)胞系耐受力強(qiáng),。但總體來(lái)說(shuō),，細(xì)胞耐酸性比耐堿性強(qiáng)一些。在配制培養(yǎng)用液時(shí),，需要注意一點(diǎn)：培新配的培養(yǎng)基在經(jīng)過(guò)0.10um或0.22um濾膜過(guò)濾時(shí),，溶液的pH還會(huì)向上浮動(dòng)0.2左右。

4.購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形,？

    答：研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤,，造成細(xì)胞的物理性損傷,，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,，應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可,。但對(duì)于DMSO敏感的細(xì)胞，還是復(fù)蘇細(xì)胞時(shí),，用離心去除DMSO比較好,。

5.購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？

    答：研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳,，原因比較復(fù)雜,，常見(jiàn)原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳,；解凍過(guò)程錯(cuò)誤,；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心,；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞,；培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤,；細(xì)胞置于–80 ℃太久等。建議嚴(yán)格參照ATCC或ECACC的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇,、凍存等工作,。

6.支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？

    答：支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù),、代謝及研究之任一數(shù)據(jù),。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義,。

7.冷凍保存細(xì)胞之方法？

    答：冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃（30－60 分鐘）→-20℃（ 30 分鐘） → -80℃（16－18 小時(shí)或隔夜）→ 液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3℃至–80 ℃以下,， 再放入液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。注意：-20℃不可超過(guò)1 小時(shí),，以防止冰晶過(guò)大,，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃冰箱中,，惟存活率稍微降低一些,。

8.懸浮細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？

    答：一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)瓶中,，稀釋細(xì)胞濃度即可,。若培養(yǎng)液太多時(shí)可分瓶取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度,，重復(fù)前述步驟即可,。

9.欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái)，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速,？

    答：欲回收動(dòng)物細(xì)胞,，其離心速率一般為300×g （約1,000rpm），5 - 10 分鐘,，過(guò)高之轉(zhuǎn)速過(guò)長(zhǎng)時(shí)間都將造成細(xì)胞死亡,。合適的離心轉(zhuǎn)速是根據(jù)相對(duì)離心決定。 RCF=1.119×105×r×（rpm）2,，其中 r為離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中心與離心套管底部?jī)?nèi)壁的距離,；rpm為離心機(jī)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)；RCF（relative eentrifugal force）為相對(duì)離心力,，以重力加速度g（980.66cm/s2）的倍數(shù)來(lái)表示表示單位,。

10.培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5%還是10%CO2，或者根本沒(méi)有影響,？

    答：一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng),， 而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7g時(shí),，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10% CO2,；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時(shí)，則應(yīng)使用5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞,。

11.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí),，是否應(yīng)馬上去除DMSO,？

    答：除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外,，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后,，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)方瓶中,，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可,，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。

12.冷凍管應(yīng)如何解凍,？

    答：取出冷凍管后,，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1－2 分鐘內(nèi)大部分融化,，特別注意,，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超凈工作臺(tái)操作細(xì)胞,，用75％消毒凍存管,，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí),，必須注意安全,，預(yù)防冷凍管之爆裂。

13.如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞,？

    答：將樣品適當(dāng)稀釋后,，用稀釋后的樣品和0.4％的臺(tái)盼蘭溶液按1:1混合后，用移液槍點(diǎn)樣到血球計(jì)數(shù)板,，置于倒置顯微鏡下觀察,、計(jì)數(shù)，其中藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞,，因活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭,，不被染色。

14.細(xì)胞欲冷凍保存時(shí),，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度,？

    答：冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1-8×106 cells/ml vial。

15.細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何,？

    答：動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含9 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之,。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,，故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成,。

16.如何消除組織培養(yǎng)的污染,？

    答：當(dāng)重要的培養(yǎng)細(xì)胞污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染,。首先,，確定污染物是細(xì)菌、真菌,、支原體或酵母,，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開(kāi)，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái),，檢查HEPA過(guò)濾器,。

　　高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而,，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平,。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂(lè)菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟,。

1）在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中消化,、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度,。

2）分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi),，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中,。例如，兩性霉素B推薦下列濃度,，0.25,，0.50，1.0,，2.0,，4.0,8.0 mg/ml。

3）每天觀測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo),，如脫落,，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓,。

4）確定抗生素毒性水平后,，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2－3代。

5）在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

6）重復(fù)步驟4,。

7）在無(wú)抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4－6代,，確定污染是否以已被消除。

17.培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)死亡其可能的原因有什么,？解決辦法有哪些,？

    答：可能的原因有培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú)CO2；培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大,；細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過(guò)程中損傷；培養(yǎng)液滲透壓不正確,；培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積等,。解決辦法可以檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度,；取新的保存細(xì)胞種,；檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓等；換入新鮮培養(yǎng)液等,。

18.國(guó)內(nèi)可以買(mǎi)到細(xì)胞株的地方有哪些,？

答：可以從國(guó)內(nèi)多家代理廠家買(mǎi)到ATCC或ECACC的細(xì)胞株，同時(shí)國(guó)內(nèi)可以買(mǎi)到細(xì)胞株的地方還有中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院（協(xié)和醫(yī)科大學(xué)）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,，中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所以及武漢大學(xué)冷藏中心等,。

19.細(xì)胞的滲透壓耐受性是多少？

    答：細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中,，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定耐受性,。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右,。對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞,，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。

20.支原體（mycoplasma） 污染的細(xì)胞,，是否能以肉眼觀察出異狀,？

    答：不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外,，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株,，無(wú)法以其外觀分辨之。

21.怎樣查到一個(gè)特定細(xì)胞株的相關(guān)知識(shí)和培養(yǎng)條件,？

    答：ATCC （American Type Culture Collection） 收集了絕大多數(shù)細(xì)胞的詳細(xì)資料,。打開(kāi)ATCC網(wǎng)頁(yè)的Cells and hybridomas鏈接，輸入細(xì)胞名稱就可以搜索ATCC的細(xì)胞數(shù)據(jù)庫(kù),。數(shù)據(jù)庫(kù)中有每一種細(xì)胞的詳細(xì)描述,，包括細(xì)胞的來(lái)源，培養(yǎng)和凍存條件,，以及相關(guān)文獻(xiàn)等資料,。

22.為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?

    答：胰蛋白酶在4℃就可能開(kāi)始降解,，如果在室溫下放置超過(guò)30分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定,。