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生物化學實驗基本技術(shù)：破碎技術(shù)
點擊次數(shù)：4574 發(fā)布時間：2010-7-26
除了某些細胞外的多肽激素和某些蛋白質(zhì)與酶以外,，對于細胞內(nèi)或多細胞生物組織中的各種生物大分子的分離純化,，都需要事先將細胞和組織破碎，使生物大分子充分釋放到溶液中,，并不丟失生物活性,。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一,，使用的方法也不相同,，如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎,，植物和微生物由于具有較堅固的纖維素,、半纖維素組成的細胞壁，要采取專門的細胞破碎方法,。
1.機械破碎
（1）研磨
研磨是將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中,，加入少量石英砂研磨或勻漿，即可將動物細胞破碎,，這種方法比較溫和,，適宜實驗室使用。工業(yè)生產(chǎn)中可用電磨研磨,。細菌和植物組織細胞的破碎也可用此法,。
（2）勻漿
勻漿這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C將組織打碎,，然后再用10000r/min-20000r/min 的內(nèi)刀式組織搗碎機（即高速分散器）將組織的細胞打碎，為了防止發(fā)熱和升溫過高,，通常是轉(zhuǎn)10秒-20秒,，停10秒-20秒，可反復(fù)多次,。
（3）膠體磨
膠體磨的基本原理是流體或半流體物料在離心力的作用下,，強制通過高速相對運動的定齒與動齒之間，使物料受到強大的剪切力,，磨擦力,、高頻振動和高速旋渦等復(fù)雜力等作用,，有效地被粉碎,、乳化,、均質(zhì)、混合,，從而達到精細超微的效果,。定轉(zhuǎn)子間的高速相對運動是使膠體磨工作獲得物理微細度的主要條件，只有提高磨盤的精密度與線速度,，才能達到良好的加工效果,。
2. 物理破碎
（1）壓榨
壓榨是一種溫和的、*破碎細胞的方法,。在1000×105Pa-2000×105Pa 的高壓下使幾十毫升的細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓,，細胞將*破碎。這是一種較理想的破碎細胞的方法,，但儀器費用較高,。
（2）冷熱交替
冷熱交替是在90℃左右維持數(shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻,，如此反復(fù)多次,，絕大部分細胞可以被破碎，細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此技術(shù),。
（3）反復(fù)凍融
反復(fù)凍融是將待破碎的細胞冷至15℃-20℃,，然后放于室溫（或40℃）迅速融化，如此反復(fù)凍融多次,，由于細胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞破碎,。
（4）超聲波
超聲波是借助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時,，時間要長一些,，處理的效果與樣品濃度和使用頻率有關(guān)。使用時注意降溫,，防止過熱,。
3.化學與生物化學破碎
（1）有機溶劑
有機溶劑是利用氯仿、甲苯,、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞,，
可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂,，此技術(shù)也可以與研磨法聯(lián)合使用,。
（2）自溶
自溶是將新鮮的生物材料存放于一定的pH 和適當?shù)臏囟认拢毎Y(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解,，使細胞內(nèi)含物釋放出來,，此法稱為自溶法。該法使用時要特別小心操作，因為水解酶不僅可以使細胞壁和膜破壞,，同時也有可能會把某些要提取的有效成分分解,。
（3）溶脹
溶脹是在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差,，溶劑分子大量進入細胞,，將細胞膜脹破釋放出細胞內(nèi)含物。
（4）酶解
酶解是利用各種水解酶,，如溶菌酶,、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等,，于37℃,，pH8，處理15分鐘,，可以專一性地將細胞壁分解,，釋放出細胞內(nèi)含物，酶解破碎適用于多種微生物,。例如從某些細菌細胞提取質(zhì)粒DNA 時,，可采用溶菌酶（來自蛋清）破細胞壁，而在破酵母細胞時,，常采用蝸牛酶（來自蝸牛）,，將酵母細胞懸于0.1mmol/L 檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液（pH=5.4）中，加1%蝸牛酶,，在30℃處理30分鐘,，即可使大部分細胞壁破裂，如同時加入0.2%疏基乙醇效果會更好,。此法可以與研磨聯(lián)合使用