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白細胞介素-2（IL-2）生物學活性測定
點擊次數(shù)：2293 發(fā)布時間：2010-7-21
白細胞介素-2（IL-2）生物學活性測定
實驗目的
1. 掌握IL-2生物學活性測定的原理。
2. 熟悉IL-2生物學活性測定的實驗方法和結(jié)果計算,。
實驗原理
IL-2是由Th細胞產(chǎn)生的淋巴因子，在淋巴細胞增殖分化過程中起到非常重要的作用,。IL-2活性測定基于IL-2能維持IL-2依賴細胞的代謝和存活,，促進這類細胞的增殖。細胞在增殖時能量代謝活躍,，可產(chǎn)生大量的能量以供合成多種大分子物質(zhì)和細胞分裂所需,，能量代謝的水平與細胞合成DNA水平基本平行,，因此，測定細胞能量代謝的水平可以間接地反映細胞增殖情況,。
MTT（四甲基偶氮唑鹽）是一種淡黃色的水溶性化合物,，活細胞（特別是增殖期的細胞）通過線粒體能量代謝過程中的琥珀酸脫氫酶的作用，使淡黃色的MTT分解產(chǎn)生藍色結(jié)晶狀甲臢沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍,，且形成甲臢的量與細胞增殖程度呈正比,，甲臢經(jīng)SDS作用后可溶解顯色。溶解液的光密度值與細胞代謝及IL-2活性正相關,。
實驗材料
1. 1640培養(yǎng)液（*）,、IL-2標準品、待測IL-2樣品,、CTLL-2細胞株,、MTT溶液（5mg/ml）、10%SDS
2. 96孔細胞培養(yǎng)板,、多頭細胞收集器,、微量加樣器、CO2孵箱,、酶標儀
實驗方法
1. 制備CTLL-2細胞懸液 取生長旺盛的CTLL-2細胞,，用1640培養(yǎng)液將細胞洗3次，用*1640培養(yǎng)液配成2×105/ml細胞懸液,。
2. 稀釋樣品和標準品 將待測樣品和標準IL-2用*1640培養(yǎng)液做一定的倍比稀釋,。
3. 加樣與檢測 向96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入不同稀釋度的樣品和標準品（50μl/孔），每稀釋度3個復孔,，并設細胞對照,。再向各孔加入50μl細胞懸液，混勻,，置5%CO237℃培養(yǎng)36小時,，每孔加入MTT溶液20μl CO2孵育6～8小時后，每孔再加10%SDS100μl,，充分混勻,，37℃孵箱靜放（使甲臢全溶解）。在酶聯(lián)儀上選波長570nm測定OD值,，將待測樣品的OD值與標準品OD值比較后,，求得待測樣品的IL-2活性單位。
結(jié)果計算
將各稀釋度的OD值按照樣品zui大增殖OD值的百分比換算成概率單位,，可將原來呈S形的曲線轉(zhuǎn)換成為直線,。根據(jù)這些點的數(shù)據(jù)求出各直線的回歸方程。再從回歸方程求出各樣品達50%zui大增殖時的稀釋度，然后按公式求出待測樣品IL-2的活性單位,。
注意事項
1. MTT液要現(xiàn)配現(xiàn)用,，避免光照，若有藍色顆粒需過濾后再用,。
2. 生物學測定法敏感性高，特異性強,，所測IL-2是具有生物活性的IL-2,，而不象免疫學測定法所測定免疫反應性IL-2蛋白，因此測定的條件和要求要嚴格按規(guī)程,。