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胰蛋白酶的制備及活力的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)原理

胰蛋白酶是以無(wú)活性的酶原形式存在于動(dòng)物胰臟中,，在Ca2+的存在下，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活,，從肽鏈N端賴氨酸和異亮氨酸殘基之間的肽鍵斷開,，失去一段六肽，分子構(gòu)象發(fā)生一定改變后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌浮?/p>

胰蛋白酶原的分子量約為24000,，其等電點(diǎn)約為pH8.9,，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近（23300），其等電點(diǎn)約為pH10.8,，zui適pH7.6～8.0,，在pH=3時(shí)zui穩(wěn)定，低于此pH時(shí),，胰蛋白酶易變性,，在pH>5時(shí)易自溶。Ca2+離子對(duì)胰蛋白酶有穩(wěn)定作用,。

重金屬離子,，有機(jī)磷化合物和反應(yīng)物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰臟,、卵清和豆類植物的種子中都存在著蛋白酶抑制劑,。zui近發(fā)現(xiàn)在一些植物的塊基（如土豆,、白薯、芋頭等）中也存在有胰蛋白酶抑制劑,。

胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解,，對(duì)于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性,。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵,，其高度專一性仍表現(xiàn)為對(duì)堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶對(duì)這些鍵的敏感性次序?yàn)椋乎ユI> 酰胺鍵> 肽鍵,。因此可利用含有這些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物來(lái)測(cè)定胰蛋白酶的活力,。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺（簡(jiǎn)稱BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（簡(jiǎn)稱BANA）測(cè)定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（簡(jiǎn)稱BAEE）和對(duì)甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（簡(jiǎn)稱TAME）測(cè)定酯酶活力,。本實(shí)驗(yàn)以BAEE為底物,，用紫外吸收法測(cè)定胰蛋白酶活力。酶活力單位的規(guī)定常因底物及測(cè)定方法而異,。

從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋白酶時(shí),，一般是用稀酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來(lái)，然后再根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理,，調(diào)節(jié)pH以沉淀除去大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì),，再以硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原等（包括大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和彈性蛋白酶原）沉淀析出,。經(jīng)溶解后,，以極少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌福拥鞍酌负蛷椥缘鞍酌竿瑫r(shí)也被激活）,，被激活的酶溶液再以鹽析分級(jí)的方法除去糜蛋白酶及彈性蛋白酶等組分,。收集含胰蛋白酶的級(jí)分，并用結(jié)晶法進(jìn)一步分離純化,。一般經(jīng)過(guò)2～3次結(jié)晶后,，可獲得相當(dāng)純的胰蛋白酶，其比活力可達(dá)到8000～10000BAEE單位/毫克蛋白,，或更高,。

如需制備更純的制劑，可用上述酶溶液通過(guò)親和層析方法純化,。

試劑和器材

一,、試劑

pH2.5乙酸酸化水,；2.5mol/L H2SO4,；5 mol/L NaOH；2 mol/L NaOH,；2mol/L HCl,；0.001M

HCl,；硫酸銨；氯化鈣,。

0.8 mol/L pH9.0硼酸緩沖液：取20ml 0.8 mol/L硼酸溶液,，加80ml 0.2 mol/L四硼酸鈉溶液，混合后,，用pH計(jì)檢查校正,。

0.4 mol/L pH9.0硼酸緩沖液（用0.8 mol/L稀釋1倍即可）；

0.2 mol/L pH8.0硼酸緩沖液：取70ml 0.2 mol/L硼酸溶液,，加30ml 0.5 mol/L四硼酸鈉溶液,，混合后，用pH計(jì)校正,。

0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 緩沖液：取50mL 0.1 mol/LTris加29.2 mL mol/L HCl 加水定容至100mL,。

底物溶液的配制：即每毫升0.05 mol/L pH8.0 Tris－HCl 緩沖液中加0.34毫克BAEE和2.22毫克的氯化鈣。

二,、材料

新鮮或冰凍豬胰臟

三,、儀器

食品加工機(jī)和高速分散器；研缽,；大玻璃漏斗,；布氏漏斗；抽濾瓶,；紗布,；恒溫水浴,；紫外分光光度計(jì),；秒表；pH試紙,。

操作方法

一,、豬胰蛋白酶制備

（一）豬胰蛋白酶原的提取

• 豬胰臟1.0Kg（新鮮的或殺后立即冷藏的），除去脂肪和結(jié)締組織后,，絞碎,。
• 加入2倍體積預(yù)冷的乙酸酸化水（pH2.5）于10～15℃攪拌提取24小時(shí)，四層紗

布過(guò)濾得乳白色濾液,，用2.5M H2SO4調(diào)pH至2.5～3.0,，放置3～4小時(shí)后用折迭濾紙過(guò)濾得黃色透明濾液（約1.5升）。

• 加入固體硫酸銨（予先研細(xì)）,，使溶液達(dá)0.75飽和度（每升濾液加492克）放置過(guò)

夜后抽濾（擠壓干）,，得豬胰蛋白酶原粗制品。

（二）胰蛋白酶原激活

• 向胰蛋白酶原粗制品濾餅分次加入10倍體積（按餅重計(jì)）冷的蒸餾水,，使濾餅溶

解,，得胰蛋白酶原溶液,。將研細(xì)的固體無(wú)水氯化鈣慢慢加入酶原溶液中（濾餅中硫酸銨的含量按餅重的四分之一計(jì)），使Ca2+與SO42-結(jié)合后,，邊加邊攪拌均勻,，邊加邊攪拌，使溶液中zui終仍含有0.1M CaCl2,。

2．用5M NaOH調(diào)pH至8.0,，加入極少量豬胰蛋白酶（約2-5mg）輕輕攪拌，于室溫下活化8～10小時(shí),，（2～3小時(shí)取樣一次,，并用0.001M HCl稀釋），測(cè)定酶活性增加的情況,。

3．活化完成（比活約3500～4000BAEE單位）后,，用2.5M H2SO4調(diào)pH至2.5～3.0，抽濾除去CaSO4沉淀,。

（三）胰蛋白酶的分離

1．將已激活的胰蛋白酶溶液按242克/升加入細(xì)粉狀固體硫酸銨,，使溶液達(dá)到0.4飽和度，放置數(shù)小時(shí)后,，抽濾,，棄去濾餅。

2．濾液按250克/升加入研細(xì)的硫酸銨,，使溶液飽度達(dá)到0.75,，放置數(shù)小時(shí)，抽濾,，棄去濾液,。

（四）胰蛋白酶的結(jié)晶

1．將上述胰蛋白酶濾餅（粗胰蛋白酶）溶解后進(jìn)行結(jié)晶：按每克濾餅溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸緩沖液的量計(jì)加入緩沖液，小心攪拌溶解,。

2．用2M NaOH調(diào)pH至8.0,，注意要小心調(diào)節(jié)，偏酸不易結(jié)晶,，偏堿易失活,，存放于冰箱。3．放置數(shù)小時(shí)后,，應(yīng)出現(xiàn)大量絮狀物,，溶液逐漸變稠呈膠態(tài)，再加入總體積的1/4～1/5的pH8.0的0.2M硼酸緩沖液,，使膠態(tài)分散,，必要時(shí)加入少許胰蛋白酶晶體。

4．放置2～5天可得到大量胰蛋白酶結(jié)晶，待結(jié)晶析出*時(shí),，抽濾,，母液回收,。

（五）胰蛋白酶的重結(jié)晶

將*次結(jié)晶的胰蛋白酶產(chǎn)物進(jìn)行重結(jié)晶：用約1倍的0.025M HCl,，使上述結(jié)晶分散，加入約1.0～1.5倍體積的pH9.0 的0.8M硼酸緩沖液,，至結(jié)晶酶全部溶解,，取樣后，用2M NaOH調(diào)溶液pH至8.0（準(zhǔn)確）（體積過(guò)大,，很難結(jié)晶）,，冰箱放置1～2天，可將大量結(jié)晶抽濾得第二次結(jié)晶產(chǎn)物（母液回收）,，冰凍干燥后得重結(jié)晶的豬胰蛋白酶,。

二、胰蛋白酶活性的測(cè)定

以苯甲酰L—精氨酸乙酯（英文縮寫為BAEE）為底物,，用紫外吸收法進(jìn)行測(cè)定,。苯甲酰L—精氨酸乙酯在波長(zhǎng)253nm下的紫外吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于苯甲酰L—精氨酸（英文縮寫為BA）。在胰蛋白酶的催化下,，隨著酯鍵的水解,，苯甲酰L—精氨酸逐漸增多，反應(yīng)體系的紫外吸收宜隨之相應(yīng)增加,。

取2個(gè)光程為1厘米的帶蓋石英比色杯,，分別加入25℃予熱過(guò)的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl,，作為空白,，校正儀器的253nm處光吸收零點(diǎn)。再在另一比色杯中加入0.2ml待測(cè)酶液（用量一般為10微克結(jié)晶的胰蛋白酶）,，立即混勻并記時(shí),，每半分鐘讀數(shù)一次，共讀3~4分鐘,?？刂艱A253/min 在0.05 ~ 0.100左右為宜。

繪制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線,，從曲線上求出反應(yīng)起始點(diǎn)吸光度隨時(shí)間的變化率（即初速度）DA253/min,。

胰蛋白酶活力單位的定義規(guī)定為：以BAEE為底物反應(yīng)液pH8.0，25℃,，反應(yīng)體積3.0ml,，光徑1厘米的條件下，測(cè)定DA253，每分鐘使DA253增加0.001,，反應(yīng)液中所加入的酶量為一BAEE單位,。

胰蛋白酶溶液的活力單位（BAEE單位/ mL）＝

胰蛋白酶比活力（BAEE單位 / mg ）＝

注意事項(xiàng) 

（1）胰臟必需是剛屠宰的新鮮組織或立即低溫存放的，否則可能因組織自溶而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗,。

（2）在室溫14～20℃條件下8～12小時(shí)可激活*,，激活時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因酶本身自溶而會(huì)使比活降低,，比活性達(dá)到“3000～4000BAEE單位/mg蛋白”時(shí)即可停止激活,。

（3）要想獲得胰蛋白酶結(jié)晶，在進(jìn)行結(jié)晶時(shí)應(yīng)十分細(xì)心地按規(guī)定條件操作,，切勿粗心大意,，前幾步的分離純化效果愈好，則培養(yǎng)結(jié)晶也較容易,，因此每一步操作都要嚴(yán)格,。酶蛋白溶液過(guò)稀難形成結(jié)晶，過(guò)濃則易形成無(wú)定形沉淀析出,，因此,，必需恰到好處，一般來(lái)說(shuō)待結(jié)晶的溶液開始時(shí)應(yīng)略呈微渾濁狀態(tài),。

（4）過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)影響結(jié)晶的形成及酶活力變化,，必須嚴(yán)格控制PH。

（5）*次結(jié)晶時(shí),，3～5天后仍然無(wú)結(jié)晶,，應(yīng)檢查pH，必要時(shí)調(diào)整pH或接種,，促使結(jié)晶形成,。重結(jié)晶時(shí)間要短些。