抗體的制備方法與原理

一,、抗血清的制備

　　有了質(zhì)量好的抗原，還必須選擇適當(dāng)?shù)拿庖咄緩?，才能產(chǎn)生質(zhì)量好（特異性強(qiáng)和效價高）的抗體,。

　　（一）用于免疫的動物

　　作免疫用的動物有哺乳類和禽類,，主要為羊,、馬、家兔,、猴,、豬、豚鼠,、雞等,，實(shí)驗(yàn)室常用者為家兔、山羊和豚鼠等,。動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量,，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊,，因動物反應(yīng)良好,，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清，用于免疫的動物應(yīng)適齡,，健壯,，無感染性疾患，為///雄性,，此外還需十分注意動物的飼養(yǎng),，以消除動物的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔,，用純種新西蘭兔,，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜,。

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　　免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi),、腹腔內(nèi),、肌肉內(nèi)、皮內(nèi),、皮下,、淋巴結(jié)內(nèi)注射等,，一般常用皮下或背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每點(diǎn)注射0.1ml左右,。途徑的選擇決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性,，如激素、酶,、毒素等生物學(xué)活性抗原,，一般不宜采用靜脈注射。

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　　由于不同個體對同一抗原的反應(yīng)性不同,，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在注射抗原的同時,，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì),，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑,。

　　佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時間,，增加抗原刺激作用外，更主要的是,，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用,，從而增強(qiáng)機(jī)體對抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生,。

　　常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份,，羊毛脂與石臘油的比例,，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），這是不*福氏佐劑,，在每毫升不*佐劑加入1～20mg卡介苗就成為*佐劑,。

　　配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻,，高壓滅菌,，置4℃下保存?zhèn)溆谩Ｃ庖咔叭〉热莘e*或不*佐劑與免疫原溶液混合,，用振蕩器混勻成乳狀,，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加）,，加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內(nèi)*不擴(kuò)散為止,。為避免損失抗原,，亦可用一注射器裝抗原液,，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接,，然后二者來回反復(fù)抽吸,，約數(shù)十分鐘后即能*乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用,。

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　　抗原劑量，劑量為300～500μg,，加強(qiáng)免疫的劑量約為劑量為1/4左右,。每2～3周加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫時用不*佐劑,，免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml,，加強(qiáng)免疫時不必注射百日咳疫苗。

　　在第2次加強(qiáng)免疫后2周,，從耳緣靜脈取2～3ml血,，制備血清，檢測抗體效價（見后）,。如未達(dá)到預(yù)期效價,，需再進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時為止（圖2-3）,。當(dāng)抗體效價達(dá)到預(yù)期水平時,，即可放血制備抗血清。

圖2-3 抗體反應(yīng)

　?。ㄎ澹┛寡宓牟杉c保存

　　家兔是zui常用以產(chǎn)生抗體的動物,，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈,、動脈取血,，鼠等小動物取血可參閱有關(guān)資料。取兔血有兩種方法,，一是耳緣靜脈或耳動脈放血,，一是頸動脈入血，也可心臟采血,。取動脈或靜脈放血時,，將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外,，也可由另一人捉住兔身,。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓,，30s后,，耳血管擴(kuò)張,、充血。用手輕拉耳尖,，以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片,，快速切開動脈或靜脈，血液即流出,，每次可收集30～40ml ,。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯,。二星期后,，可在另一耳放血。此法可反復(fù)多次放血,。頸動脈放血時,，將兔仰臥，固定于兔臺,，剪去頸部的毛,，切開皮膚，暴露頸動脈,，插管,，放血。放血過程中要嚴(yán)格按無菌要求進(jìn)行,。

　　收集的血液置于室溫下1h左右,，凝固后，置4℃下,，過夜（切勿冰凍）析出血清,，離心，4000rpm,10min,。在無菌條件,，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml）,，貯于-40℃以下冰箱,，或凍干后貯存于4。C冰箱保存,。

　?。┛寡遒|(zhì)量的評價

　　在免疫期間，不僅各個不同的動物,，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價,、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化,，因而必須經(jīng)常地采血測試,。只有在對抗血清的效價,、特異性、親合力等方面作*的評價后,，才可使用所取得的抗血清。

　　1．效價 　抗血清的效價,，就是指血清中所含抗體的濃度或含量,。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用,。某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體,，可用雙擴(kuò)散等方法測定。前者測定的效價極為,。而后者則粗糙得多,。

　　（1）放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與標(biāo)記抗原混合,，孵育24h后,，測定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%的血清稀度和為效價,。如某抗血清的結(jié)合率為50%時的稀釋度為1：15000,，則該血清的效價就是1：15000?？寡宓男r,，除由抗血清本身的性質(zhì)決定外，還受標(biāo)記抗原的質(zhì)量,、孵育時間,，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意,。（測定方法見第8章?。?/p>

　　（2）雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散,，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線,，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。

　　球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內(nèi),，于水浴中加溫,，攪拌，使瓊脂*溶解,，趁熱用紗布過濾,，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉（NaN3）,，使其在溶液中的濃度為0.1%,。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上,，約3mm厚，待其冷卻,，*凝固后,，用打孔器打孔（圖2-4）。中央孔內(nèi)加適量抗原（容量為50μl）,，周圍各孔內(nèi)分別加入50μl 1：2,、1：4、1：8,、1：16,、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h,，觀察有無沉淀線產(chǎn)生,，以判斷血清的稀釋度（圖2-5）。

圖2-4 雙向擴(kuò)散模型

圖2-5 免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

　　2．特異性測定 　　抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力,。特異性好就是抗血清的識別能力強(qiáng),。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的,。交叉反應(yīng)率低,，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差,。交叉反應(yīng)率一般是用競爭抑制曲線來判斷的,。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競爭抑制曲線，計算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0）,，求出各自在IC50時的濃度,，按下列公式計算交叉反應(yīng)率。

　　S=y/Z×100%

　　S：交叉反應(yīng)率,，y：IC50時抗原濃度,，Z：IC50時近似抗原物質(zhì)的濃度。

　　如某抗原的IC50濃度為90Pg/管,，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無限大,，可以說這一抗血清與其它抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無交叉反應(yīng),，該抗血清的特異性是好的,。

　　3．親合力 　　在免疫學(xué)中， 親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度,?？贵w與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會迅速解離，稱為親合力低,，反之,，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小,，抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的,。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）,。在RIA中,，K是該抗血清能達(dá)到的zui小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/[H],，[H]是zui小檢出量，通常,，K的范圍在108～1012L/mol之間,，也有高達(dá)1014L/mol的。

　　計算親合常數(shù)的方法20余種,，計算出的K都不能真實(shí)反映實(shí)驗(yàn)情況,，只能作為參考。

　?。ㄆ撸┟庖呤〉目赡茉蚣皯?yīng)采取的措施

　　有時不能獲得滿意的抗血清,，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之,。

　?。?）免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系,，或擴(kuò)大免疫動物的數(shù)量,。

　　（2）抗原質(zhì)量是否良好,，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號,，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法,。

　?。?）制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑,，載體,、抗原或載體的比例、反應(yīng)時間等多方面去考慮,，并加以改進(jìn),。

　　（4）所用的佐劑是否合適，乳化是否*,，可改用其它佐劑,，或加強(qiáng)乳化。

　?。?）免疫的方法,、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時間和次數(shù),，免疫的途徑是否合適,。

　　（6）動物的飼養(yǎng)是否得當(dāng),，如營養(yǎng)（飼料,、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng),、采光,、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等,。

　　二,、單克隆抗體的制備

　　1975年Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體,，又可無性繁殖,，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破使血清學(xué)的研究進(jìn)入了一個高度的新紀(jì)元,。

　　免疫細(xì)胞化學(xué)的 技術(shù)關(guān)鍵之一是制備特異性強(qiáng),、親合力大、滴度高的特異性抗體,，由于每種抗原都有幾個抗原決定簇,，用它免疫動物將產(chǎn)生對各個決定簇的抗體，即多克隆抗體,。單克隆抗體則是由一個產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與一個骨髓瘤細(xì)胞融合而形成的雜交廇細(xì)胞經(jīng)無性繁殖而來的細(xì)胞群所產(chǎn)生的,，所以它的免疫球蛋白屬同一類型，質(zhì)地純一,，而且它是針對某一抗原決定簇的,，因此特異性強(qiáng)，親合性也一致,。單克隆抗體（McAb）的特性和常規(guī)血清抗體的特性比較見2-3,。

表2—3 單克隆抗體（McAb）和常規(guī)免疫血清抗體的特性比較

　　單克隆抗體的制備方法如下,。

　　（一）動物的選擇與免疫

　　1．動物的選擇 　純種BALB/C小鼠,，較溫順,，離窩的活動范圍小，體弱,，食量及排污較小,，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種BALA/C小鼠,。

　　2．免疫方案 　　選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功,，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫,，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定,。

　　（1）可溶性抗原免疫原性較弱,，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原,，再加佐劑,。常用佐劑：福氏*佐劑、福氏不*佐劑,。

　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏*佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點(diǎn)）

　　↓3周后

　　第二次免疫 劑量同上,，加福氏不*佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）

　　↓3周后

　　第三次免疫 劑量同一，不加佐劑,，ip（5～7天后采血測其效價）

　　↓2～3周

　　加強(qiáng)免疫,，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前,，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新,，如：①將可溶性抗原顆粒化或固相化,，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性,，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑,，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射,。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平,，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對抗原的反應(yīng)性,。

　　（2）顆粒抗原免疫性強(qiáng),，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果,。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細(xì)胞,。

　　初次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓2～3周后

　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓3周后

　　加強(qiáng)免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

　　↓

　　取脾融合

　?。ǘ┘?xì)胞融合

　　1．細(xì)胞融合前準(zhǔn)備

　　（1）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系,，這樣雜交融合率高,，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細(xì)胞系見表2-4,。

表2-4用于融合試驗(yàn)的主要骨髓瘤細(xì)胞系

　　骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液,，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基,。小牛血清的濃度一般在10%～20%,，細(xì)胞濃度以104～5×105/ml為宜，zui大濃度不得超過106/ml,。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長的中期時,，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次,。細(xì)胞在傳代過程中,，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥嘌呤進(jìn)行處理,，使生存的細(xì)胞對HAT呈均一的敏感性,。

　　（2）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中,，單個或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖,，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長繁殖,，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞,。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)　需要加飼養(yǎng)細(xì)胞,，如在雜交瘤細(xì)胞篩選,、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的,。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）,、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞,。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2×104或105細(xì)胞/孔,。

　　2．細(xì)胞融合的步驟

　?。?）制備飼養(yǎng)細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

　　與免疫小鼠相同品系的小鼠,，常用BALB/C小鼠,，6～10周

↓

　　拉頸 處死，浸泡在75%酒精內(nèi),，3～5min

　　↓

　　用無菌剪刀剪開皮膚,，暴露腹膜

　　↓

　　用無菌注射器注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管）

　　↓

　　反復(fù)沖洗，吸出沖洗液

　　↓

　　沖洗液放入10ml離心管,，1200rpm/分離5～6min

　　↓

　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸,，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37,。c CO2孵箱培養(yǎng)

　?。?）制備免疫脾細(xì)胞

　　zui后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死

　　↓

　　無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次

　　↓

　　脾臟研碎,，過不銹鋼篩網(wǎng)

　　↓

　　離心,，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次

　　↓

　　計數(shù)

　　↓

　　取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用

　　（3）制備骨髓瘤細(xì)胞

　　取對數(shù)生長骨髓瘤細(xì)胞離心

　　↓

　　用無血清培養(yǎng)液洗2次

　　↓

　　計數(shù),，取得×107細(xì)胞備用

　?。?）融合

　　①將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起,，在50ml離心管中用無血清不*培養(yǎng)液洗1次,，離心，1200rpm,8min;棄上清,，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度,。輕輕彈擊離心管底,，使細(xì)胞沉淀略松動。

　?、?0s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液,，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s,。

　?、奂?7。C預(yù)溫的不*培養(yǎng)液以終止PEG作用,，每隔2min分別加入1ml,、2ml、3ml,、4ml,、5ml和6ml,。

　　④離心,，800rpm, 6min,。

　　⑤充上清,，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸,。

　　⑥將上述細(xì)胞,，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi),，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板,。

　?、邔⑴囵B(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

　?。ㄈ┻x擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測

　　1．HAT選擇雜交瘤細(xì)胞 　　　脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體,，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義,。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶,，故不能生長繁殖,，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖,。

　　在用HAT選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi),，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3～4天后瘤細(xì)胞消失,，雜交細(xì)胞形成小集落,，HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周,，改用一般培養(yǎng)液,。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時,，即可開始檢測特異性抗體,，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間,，一般每2～3天換一半培養(yǎng)液,。

　　2．抗體的檢測　　 檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同,，選擇不同的篩選方法,，一般以快速,、簡便、特異,、敏感的方法為原則,。

　　常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測,。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）可用于可溶性抗原,、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗(yàn)適合于細(xì)胞表面抗原的McAb的檢測,。（4）其它如間接血凝試驗(yàn),、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗(yàn)等,。

　?。ㄋ模╇s交瘤的克隆化

　　雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。因?yàn)榻?jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆,。在實(shí)際工作中,，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞,、抗體非分泌細(xì)胞,、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開就需要克隆化,?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進(jìn)行克隆化,，否則抗體分泌的細(xì)胞會被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制,，因?yàn)榭贵w非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細(xì)胞丟失,。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆,，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力,。

　　克隆化的方法很多，zui常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法,。

　　1．有限稀釋法克隆

　?。?）克隆前1天制備飼養(yǎng)細(xì)胞層（同細(xì)胞融合）。

　　2）將要克隆的雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干,，計數(shù),。

　　（3）調(diào)整細(xì)胞為3～10個細(xì)胞/ml,。

　?。?）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)板,，每孔加入稀釋細(xì)胞100μl。孵育于37℃,、5%CO2孵箱中 ,。

　　（5）在第7天換液,，以后每2～3天換液1次,。

　　（6）8～9天可見 細(xì)胞克隆形成,，及時檢測抗體活性,。

　　（7）將陽性孔的細(xì)胞移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng),。

　?。?）每個克隆應(yīng)盡快凍存。

　　2．軟瓊脂培養(yǎng)法克隆

　?。?）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640,。

　　①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌,，42℃預(yù)熱,。

　　②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成,。置42℃保溫,。

　　（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細(xì)胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中,，在室溫中待凝固后作為基底層備用,。

　　（3）按100/ml,，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液,。

　　（4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合,。

　?。?）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min,，使其凝固,，孵育于37℃、5%CO2孵箱中,。

　?。?）4～5天 后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后,，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔中進(jìn)行培養(yǎng),。

　?。?）檢測抗體，擴(kuò)大培養(yǎng),，必要是地再克隆化,。

　　（五）雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

　　1．雜交瘤細(xì)胞的凍存　　 及時凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的,。因?yàn)樵跊]有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時候,，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等,。如果沒有原始細(xì)胞的凍存,，則可因上述意外而前功盡棄。

　　雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣,，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上,，但對原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),，當(dāng)長滿孔底時,，一孔就可以裝一支安瓿凍存。

　　細(xì)胞凍存液：50%小牛血清,；40%不*培養(yǎng)液,；10%DMSO（二甲基亞砜）。

　　凍存液預(yù)冷,，操作動作輕柔,、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱,，次日轉(zhuǎn)入液氮中,。也可用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇,，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性,，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長時間。

　　2．細(xì)胞復(fù)蘇方法 　將玻璃安瓿自液氮中小心取出,，放37℃水浴中,，在1min內(nèi)使凍存的細(xì)胞解凍，將細(xì)胞用*培養(yǎng)液洗滌兩次,，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi),，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),，當(dāng)細(xì)胞形成集落時，檢測抗體活性,。

　?。﹩慰寺】贵w的大量生產(chǎn)

　　大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：

　?。?）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從一清液中獲取單克隆抗體,。但此方法產(chǎn)量低,，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產(chǎn)，費(fèi)用較高,。

　?。?）體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，制備腹水或血清,。

　?、賹?shí)體瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點(diǎn),。待腫瘤達(dá)到一定大小后（一般10～20天）則可采血,，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達(dá)到1～10mg/ml。但采血量有限,。

　?、诟顾闹苽洌撼Ｒ?guī)是先腹腔注射0.5ml Pristane （降植烷）或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細(xì)胞,，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水,，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多,，而小鼠頻于死亡之前,，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中,，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水,。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次,。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)到5～10mg/ml,，這是目前zui常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來,，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊,、量多。

　?。ㄆ撸﹩慰寺】贵w的鑒定

　　對制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的,，應(yīng)做下述幾個方面的鑒定：

　　1．抗體特異性的鑒定 　　除用免疫原（抗原）進(jìn)行抗體的檢測外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗(yàn),，方法可用ELISA,、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外,，還應(yīng)該用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng),，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體,，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng),，其次是與其它細(xì)胞因子間有無交叉。

　　2．McAb的Ig類與亞類的鑒定　　一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型,。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM,，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來確定,。在作雙擴(kuò)試驗(yàn)時,，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成,。

　　3．McAb中和活性的鑒定 　　　用動物或細(xì)胞的保護(hù)實(shí)驗(yàn)來確定McAb的生物學(xué)活性,。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性,，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細(xì)胞,，來觀察動物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。

　　4．McAb識別抗原表位的鑒定　　用競爭結(jié)合試驗(yàn),，測相加指數(shù)的方法,，測定McAb所識別抗原位點(diǎn)，來確定McAb的識別的表位是否相同,。

　　5．McAb親合力的鑒定　 用ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗(yàn)來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力,。