植物病毒病檢測(cè)方法

植物病毒病是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上一種重要病害,，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量, 目前還沒有1種治療效果較理想的藥劑，對(duì)發(fā)病植株做到早期診斷及提前檢測(cè)就顯得尤為重要,。植物病毒學(xué)歷經(jīng)近百年的發(fā)展,，植物病毒的檢測(cè)方法與手段也在不斷發(fā)展與改進(jìn)。常用的方法有侵染力測(cè)定法,、血清學(xué)方法,、電子顯微鏡計(jì)數(shù)和分子生物學(xué)法等。

1.4.1侵染力測(cè)定法

侵染力測(cè)定法是將病毒樣本接種在植物上,，根據(jù)侵染力的大小定量,。它的靈敏度在所有定量法中是比較高的，而且是其他定量法的基礎(chǔ),。設(shè)計(jì)一種新的定量法,，如果不經(jīng)過侵染力的驗(yàn)證，將無法判斷測(cè)定的是病毒或者是具有侵染力的病毒,。侵染力測(cè)定法包括局部枯斑法,、淀粉－碘斑法、系統(tǒng)感染率的測(cè)定法等,。侵染力測(cè)定多用粗汁液來接種,，為了避免抑制物質(zhì)的作用和使半葉枯斑數(shù)目控制在一定范圍，須用緩沖液稀釋接種物,。

局部枯斑法 1929年F.O.Holmes發(fā)現(xiàn)TMV在心葉煙（Nicotiana glutinosa）接種葉片上引起局部壞死斑點(diǎn),，在一定的病毒濃度范圍內(nèi)，所產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)目與病毒濃度成正比例,。這一發(fā)現(xiàn)成為病毒侵染性定量測(cè)定的基礎(chǔ)（田波,，1987）。所有機(jī)械傳染的病毒都有可能應(yīng)用局部斑點(diǎn)法,，但實(shí)際上只有少數(shù)病毒具有可用于定量測(cè)定的局部斑寄主,。一個(gè)待測(cè)樣品所形成的斑點(diǎn)數(shù)目除取決于接種物中病毒濃度外，還受試驗(yàn)植物種類、環(huán)境條件和接種物中是否含有病毒抑制物質(zhì)的影響,。

淀粉－碘斑法 當(dāng)所研究的病毒沒有過敏性枯斑寄主時(shí),，采用此法。Holmes（1931）發(fā)現(xiàn)TMV接種的煙葉上有時(shí)形成明顯的黃化斑塊,，但不能用于計(jì)數(shù),。將這種接種葉用95％乙醇加熱到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2,，30克KI,，1500毫升H2O）染色時(shí)，則侵染點(diǎn)處出現(xiàn)淀粉－碘的藍(lán)色反應(yīng),。當(dāng)下午采摘葉片,，褪色過夜，然后用碘液染色,，則侵染點(diǎn)較周圍組織著色淺,；當(dāng)采摘葉片前，植株先在黑暗中放幾個(gè)小時(shí),，再用碘液染色,，則侵染點(diǎn)組織著色深。這是由于病毒侵染既降低光合組織中碳水化合物的形成,，也降低碳水化合物從光合組織中的運(yùn)出,。淀粉－碘染色的強(qiáng)弱受環(huán)境條件的影響較大，不如局部枯斑法可靠,，但在標(biāo)準(zhǔn)化條件下仍可用于侵染性的定量測(cè)定,。

侵染性滴度法 當(dāng)上述方法都不適用時(shí)，可采用侵染性滴度法,。即把欲測(cè)定樣品用緩沖液稀釋,，可用十倍稀釋、成倍稀釋,、半倍稀釋或更低稀釋,。這種方法的缺點(diǎn)是需用大量實(shí)驗(yàn)植物，但可得到較好的結(jié)果,。此方法可用于介體傳染的病毒,。

1.4.2血清學(xué)方法

血清學(xué)方法原理是利用抗原抗體的體外特異性結(jié)合檢測(cè)植物病毒。主要包括沉淀反應(yīng),、凝聚反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,、免疫電鏡（IEM）,、放射免疫測(cè)定（RIA）、PCR（聚合酶蓮式反應(yīng)）法等。

沉淀反應(yīng) 將可溶性抗原與相應(yīng)的抗體混合,，當(dāng)兩者的比例合適,，并有鹽類存在時(shí)，即有沉淀物出現(xiàn),，叫做沉淀反應(yīng),。由于沉淀物主要是由抗體球蛋白所組成，為了保證有足夠的抗體,，因此試驗(yàn)時(shí)通常要稀釋抗原,，不稀釋抗體。

凝聚反應(yīng) 在微生物細(xì)胞懸液中,，加入含有特異性抗體的血清,，有一定濃度的電解質(zhì)，微生物細(xì)胞凝聚成團(tuán),，叫做凝聚反應(yīng),。分為直接凝聚反應(yīng)與間接凝聚反應(yīng)。由于病毒是可溶性抗原,，必須把病毒的抗體先吸附于一種與免疫無關(guān)的顆粒表面,，然后與相應(yīng)的抗原結(jié)合反應(yīng)。用于吸附抗體的顆粒有皂土,、乳膠,、炭末、紅細(xì)胞等,。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked Immunosorbent assay,，簡(jiǎn)稱ELISA）將酶標(biāo)記物同抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用相結(jié)合,既保持了酶催化反應(yīng)的敏感性,又保持了抗原抗體反應(yīng)的特異性,因而極大的提高了靈敏度；同時(shí)它又是一種非均相分析過程,即在反應(yīng)中的每一步之后都有洗滌過程,從而排除了未反應(yīng)物質(zhì)的干擾,。自1976年 Voller和Clark等將ELISA應(yīng)用于植物病毒檢測(cè),已形成多種測(cè)試方法,。常用的方法有有細(xì)胞直接法、細(xì)胞間接法,、競(jìng)爭(zhēng)法,、酶抗酶法、雙夾心法（Double sandwich method）,、雙抗體夾心法（Double antibody sandwich method）測(cè)定方式（侯義龍,2000）,。這種方法的靈敏度高（可測(cè)出1－10納克/毫升的濃度），特異性強(qiáng),，操作簡(jiǎn)便,，已廣泛應(yīng)用于病毒測(cè)定和診斷（盛樹力，1978,；馬德芳等,1981）,。

免疫電鏡（IEM）是用電鏡檢測(cè)抗體特異性結(jié)合于抗原的技術(shù),。Anderson等（1961）和Lafferty與Oeris（1961）發(fā)展了這一方法。其靈敏度高于ELISA,。

放射免疫測(cè)定（RIA）在抗原抗體反應(yīng)體系中,，當(dāng)同位素標(biāo)記抗原（Ag*）與有*的抗體相互作用時(shí)，形成有標(biāo)記抗原的復(fù)合物（Ag*Ab）,。如下式所示：

Ag*＋Ab Ag*Ab

Ag AgAb

1.4.3 電子顯微鏡計(jì)數(shù)

本世紀(jì)三十年代初電子顯微鏡的發(fā)明,，使我們能夠觀察到病毒的分子及其細(xì)微結(jié)構(gòu)。1940年Kausche和Melcher在電子顯微鏡下觀察到煙草花葉病毒的顆粒,。電鏡技術(shù)的建立對(duì)病毒學(xué)的發(fā)展起了巨大的推動(dòng)作用,。

在實(shí)際生產(chǎn)過程中，根據(jù)病毒的種類與特點(diǎn)的不同,，往往需要把幾種方法結(jié)合起來,，就可望建立一套快速、靈敏,、準(zhǔn)確,、的水體植物病毒的檢測(cè)方法。

1.4.4.分子生物學(xué)法

分子生物學(xué)檢測(cè)法能夠檢測(cè)病毒的侵染能力,。此方法靈敏度zui高,，能檢測(cè)到pg級(jí)甚至fg級(jí)[1ｆｇ（飛克）=1×10-15ｇ]的病毒,特異性強(qiáng)，檢測(cè)速度快,，操作簡(jiǎn)便,，可用于大量樣品的檢測(cè)（侯義龍,2000）。目前,常用的分子生物學(xué)方法有核酸分子雜交技術(shù),、dsRNA電泳技術(shù),、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)等。侯義龍.果樹主要病毒RT-PCR檢測(cè)體系的建立,、優(yōu)化及病毒特異DNA片段克隆測(cè)序研究.[博士學(xué)位論文].沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),2000.6

核酸分子雜交技術(shù) 具有一定同源性的2條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈,。此雜交過程是高度特異性的。雜交的雙方是使用的探針和要檢測(cè)—的核酸,。待測(cè)核酸可以是克隆的基因片段,也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA,。根據(jù)使用的方法,被檢測(cè)核酸可以是提純的（膜上印跡雜交或液相雜交）,也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交（細(xì)胞原位雜交） （盧圣棟，1999）,。

雙鏈RNA（dsDNA）電泳技術(shù) ssRNA病毒在植物體內(nèi)增殖,通過核酸互補(bǔ)而形成一種健康植物沒有的堿基配對(duì)dsRNA,。DsRNA經(jīng)提純、電泳,、染色后,在凝膠上所顯示的譜帶可以反映每種病毒組群的特異性,并且有些單個(gè)病毒的dsRNA在電泳圖譜上也顯示一定的特征,。因此,利用病毒dsRNA的電泳圖譜可以檢測(cè)出病毒的類型和種類（董穎蘋,2001；李鵬翔,，2000）,。此法已用于一些病毒組（如黃化病毒組,、馬鈴薯Y病毒組、番石竹潛病毒組,、煙草壞死病毒組、黃瓜花葉病毒組,、絨毛煙斑駁病毒組）的分類研究,。

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction,PCR）技術(shù) 是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，是近10年來發(fā)展和普及zui迅速的分子生物學(xué)新技術(shù)之一（吳乃虎,，2000,；）。由于它具有強(qiáng)大的擴(kuò)增能力,并且可與其它分子生物學(xué)方法（如核酸雜交）和免疫學(xué)方法（如ELISA）相結(jié)合應(yīng)用,使其敏感性和特異性都大大增強(qiáng),；因而廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的各個(gè)學(xué)科（梁國(guó)棟,，2001）。靈敏度zui高, 儀器價(jià)格昂貴,，試驗(yàn)技術(shù)要求高,。