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技術(shù)文章
分析影響ELISA中非特異性顯色的原因
點(diǎn)擊次數(shù)：2335 發(fā)布時(shí)間：2009-11-13
影響ELISA中非特異性顯色的原因很多，如試劑盒特異性,、檢驗(yàn)標(biāo)本中含酶標(biāo)記物的干擾物,，操作過(guò)程中的問(wèn)題。本文就這一原因作一簡(jiǎn)要分析,以便可以通過(guò)以上措施把非特異顯色降至zui低限度,，從而提高檢測(cè)的特異性,，并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
1,、試劑盒特異性因素
1、1 固相載體的選擇,。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板,、小珠和小試管三種，以微量滴定板zui為常見(jiàn)[1],。它具有良好的吸附性能,，孔底透明度高,，空白值低，各板之間,、同一板各孔之間性能相近,。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,。因此,，在選擇試劑盒同時(shí)要對(duì)其使用的微孔板型號(hào)進(jìn)行認(rèn)證，評(píng)估,。
1,、2包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測(cè)定尤其是間接ELISA中,，試劑的特異性取決于使用抗原的純度,。目前由于技術(shù)條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%,，所以有些非特異性顯色不可避免,，只能盡可能提高純度，提高特異性,。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原,。
1、3包被抗體的效價(jià),。具有高親和力和高特異性的包被抗體,，是決定試劑特異性的重要方面。
1,、4 封閉,。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2],，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾,。
2、檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
2,、1內(nèi)源性干擾物：類風(fēng)濕因子（RF）,、黃疸等,，類風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體,，多數(shù)為IgM類，能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng),，從而呈現(xiàn)非特異性顯色,。
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，如用辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記物,，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色,。
2,、2 外源性干擾物，常常因樣品采集,、貯存,、處理不當(dāng)造成如樣品溶血，被細(xì)菌污染,，標(biāo)本凝集不全等,。溶血標(biāo)本，紅細(xì)胞溶解破裂,，釋放出血紅素形成,，而血紅素中的鐵卟啉是過(guò)氧化物酶的類似物，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中,，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色,。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP（辣根過(guò)氧化酶）[2],，有國(guó)內(nèi)報(bào)道酶免HBsAg試劑檢測(cè)溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽(yáng)性[3],。如在冰箱中保存過(guò)久，其中的IgG可發(fā)生聚合,，在間接法ELISA中可使本底加深[2],。因此，血標(biāo)本在采集處理時(shí)應(yīng)小心,，在冰箱中保存不易過(guò)久,。
標(biāo)本凝集不全時(shí)，血清中會(huì)殘留部分纖維蛋白原,，也易造成假陽(yáng)性,。
3、操作過(guò)程中的問(wèn)題造成假陽(yáng)性
3,、1加樣
對(duì)于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋,，如果加樣不準(zhǔn)就會(huì)造成誤差，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí),，很小的誤差,，會(huì)導(dǎo)致較大的相對(duì)誤差，使陰性（或弱陽(yáng)性）標(biāo)本呈陽(yáng)性（或陰性）,。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。目前，大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本，可較好地避免以上誤差,。
3,、2洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步，應(yīng)引起操作者重視,。無(wú)論是手工操作還是機(jī)器操作,，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān)，ELISA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的,。通過(guò)洗滌以消除殘留在板孔中沒(méi)能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
3,、3 溫育
每種試劑都有其*反應(yīng)模式,，其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素。因孵育溫度高,，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),，會(huì)造成整板本底高，陽(yáng)性率高,。溫育一般用濕盒或水浴,，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡,，為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋。
3,、4酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測(cè)定結(jié)果的儀器,，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否，決定結(jié)果的可靠度,。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng),，對(duì)濾光片要定期校正；其次酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置要正確,，使用雙波長(zhǎng),，一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，一個(gè)參比波長(zhǎng),，以消除微孔板底部劃痕,、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾,。此外,，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同,，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)
綜上所述,，由于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)目前在技術(shù)上缺乏標(biāo)準(zhǔn)化,，盡管目前上以及我國(guó)有了部分標(biāo)準(zhǔn)血清或參比血清（血清盤(pán)）,。但由于受方法學(xué)及技術(shù)條件的限制,，在酶聯(lián)吸附測(cè)定中有時(shí)不可避免的會(huì)出現(xiàn)一定的非特異性，但我們可以通過(guò)以上措施把非特異性顯色降至zui低限底,，從而提高檢測(cè)的特異性,，并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
1,、試劑盒特異性因素
1、1 固相載體的選擇,。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板,、小珠和小試管三種，以微量滴定板zui為常見(jiàn)[1],。它具有良好的吸附性能,，孔底透明度高,，空白值低，各板之間,、同一板各孔之間性能相近,。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大,。因此,，在選擇試劑盒同時(shí)要對(duì)其使用的微孔板型號(hào)進(jìn)行認(rèn)證，評(píng)估,。
1,、2包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測(cè)定尤其是間接ELISA中,，試劑的特異性取決于使用抗原的純度,。目前由于技術(shù)條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%,，所以有些非特異性顯色不可避免,，只能盡可能提高純度，提高特異性,。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原,。
1、3包被抗體的效價(jià),。具有高親和力和高特異性的包被抗體,，是決定試劑特異性的重要方面。
1,、4 封閉,。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2],，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾,。
2、檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
2,、1內(nèi)源性干擾物：類風(fēng)濕因子（RF）,、黃疸等,，類風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體,，多數(shù)為IgM類，能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng),，從而呈現(xiàn)非特異性顯色,。
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，如用辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記物,，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色,。
2,、2 外源性干擾物，常常因樣品采集,、貯存,、處理不當(dāng)造成如樣品溶血，被細(xì)菌污染,，標(biāo)本凝集不全等,。溶血標(biāo)本，紅細(xì)胞溶解破裂,，釋放出血紅素形成,，而血紅素中的鐵卟啉是過(guò)氧化物酶的類似物，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中,，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色,。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP（辣根過(guò)氧化酶）[2],，有國(guó)內(nèi)報(bào)道酶免HBsAg試劑檢測(cè)溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽(yáng)性[3],。如在冰箱中保存過(guò)久，其中的IgG可發(fā)生聚合,，在間接法ELISA中可使本底加深[2],。因此，血標(biāo)本在采集處理時(shí)應(yīng)小心,，在冰箱中保存不易過(guò)久,。
標(biāo)本凝集不全時(shí)，血清中會(huì)殘留部分纖維蛋白原,，也易造成假陽(yáng)性,。
3、操作過(guò)程中的問(wèn)題造成假陽(yáng)性
3,、1加樣
對(duì)于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋,，如果加樣不準(zhǔn)就會(huì)造成誤差，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí),，很小的誤差,，會(huì)導(dǎo)致較大的相對(duì)誤差，使陰性（或弱陽(yáng)性）標(biāo)本呈陽(yáng)性（或陰性）,。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。目前，大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本，可較好地避免以上誤差,。
3,、2洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步，應(yīng)引起操作者重視,。無(wú)論是手工操作還是機(jī)器操作,，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān)，ELISA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的,。通過(guò)洗滌以消除殘留在板孔中沒(méi)能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
3,、3 溫育
每種試劑都有其*反應(yīng)模式,，其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素。因孵育溫度高,，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),，會(huì)造成整板本底高，陽(yáng)性率高,。溫育一般用濕盒或水浴,，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡,，為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋。
3,、4酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測(cè)定結(jié)果的儀器,，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否，決定結(jié)果的可靠度,。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng),，對(duì)濾光片要定期校正；其次酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置要正確,，使用雙波長(zhǎng),，一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，一個(gè)參比波長(zhǎng),，以消除微孔板底部劃痕,、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾,。此外,，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同,，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)
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