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技術(shù)文章
ELISA中分析非特異性顯色
點(diǎn)擊次數(shù)：2489 發(fā)布時(shí)間：2009-11-9
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）自1971年自問(wèn)世以來(lái),，以其敏感性高，特異性強(qiáng),，操作簡(jiǎn)便、安全,，而廣泛應(yīng)用于臨床診斷,，開(kāi)創(chuàng)了免疫學(xué)診斷的新紀(jì)元。但同其它免疫診斷方法一樣酶免試劑在它的研究,、生產(chǎn)及使用中常常會(huì)碰到非特異性問(wèn)題,。
1、試劑盒特異性因素
1,、1 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板,、小珠和小試管三種，以微量滴定板zui為常見(jiàn)[1],。它具有良好的吸附性能,，孔底透明度高，空白值低,，各板之間,、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此,，在選擇試劑盒同時(shí)要對(duì)其使用的微孔板型號(hào)進(jìn)行認(rèn)證,，評(píng)估。
1,、2包被物的純度,。在酶聯(lián)免疫測(cè)定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度,。目前由于技術(shù)條件的限制,，包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%，所以有些非特異性顯色不可避免,，只能盡可能提高純度,，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原,。
1,、3包被抗體的效價(jià)。具有高親和力和高特異性的包被抗體,，是決定試劑特異性的重要方面,。
1,、4 封閉,。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2],，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾,。
2、檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
2,、1內(nèi)源性干擾物：類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）,、黃疸等，類(lèi)風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體,，多數(shù)為IgM類(lèi)，能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng),，從而呈現(xiàn)非特異性顯色,。
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,，如用辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記物,，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色,。
2,、2 外源性干擾物,，常常因樣品采集,、貯存、處理不當(dāng)造成如樣品溶血,，被細(xì)菌污染，標(biāo)本凝集不全等,。溶血標(biāo)本,，紅細(xì)胞溶解破裂，釋放出血紅素形成,，而血紅素中的鐵卟啉是過(guò)氧化物酶的類(lèi)似物,，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色,。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP（辣根過(guò)氧化酶）[2]，有國(guó)內(nèi)報(bào)道酶免HBsAg試劑檢測(cè)溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽(yáng)性[3],。如在冰箱中保存過(guò)久,，其中的IgG可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深[2],。因此,，血標(biāo)本在采集處理時(shí)應(yīng)小心，在冰箱中保存不易過(guò)久,。
標(biāo)本凝集不全時(shí),，血清中會(huì)殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽(yáng)性,。
3,、操作過(guò)程中的問(wèn)題造成假陽(yáng)性
3,、1加樣
對(duì)于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋?zhuān)绻訕硬粶?zhǔn)就會(huì)造成誤差,，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí)，很小的誤差,，會(huì)導(dǎo)致較大的相對(duì)誤差，使陰性（或弱陽(yáng)性）標(biāo)本呈陽(yáng)性（或陰性）,。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。目前，大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本,，可較好地避免以上誤差,。
3、2洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步,，應(yīng)引起操作者重視。無(wú)論是手工操作還是機(jī)器操作,，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān),，ELISA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以消除殘留在板孔中沒(méi)能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。
3,、3 溫育
每種試劑都有其*反應(yīng)模式，其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素,。因孵育溫度高,，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)造成整板本底高,，陽(yáng)性率高,。溫育一般用濕盒或水浴，反應(yīng)板不宜疊放,，以保證各板溫度都能迅速平衡,，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋,。
3,、4酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測(cè)定結(jié)果的儀器，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,，決定結(jié)果的可靠度,。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng)，對(duì)濾光片要定期校正,；其次酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置要正確,，使用雙波長(zhǎng)，一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng),，一個(gè)參比波長(zhǎng),，以消除微孔板底部劃痕、不平,、指印或液面高度差異造成的光干擾,。此外，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)先擦試微孔板底部并壓平板條,。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同,。
1、試劑盒特異性因素
1,、1 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板,、小珠和小試管三種，以微量滴定板zui為常見(jiàn)[1],。它具有良好的吸附性能,，孔底透明度高，空白值低,，各板之間,、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此,，在選擇試劑盒同時(shí)要對(duì)其使用的微孔板型號(hào)進(jìn)行認(rèn)證,，評(píng)估。
1,、2包被物的純度,。在酶聯(lián)免疫測(cè)定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度,。目前由于技術(shù)條件的限制,，包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%，所以有些非特異性顯色不可避免,，只能盡可能提高純度,，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原,。
1,、3包被抗體的效價(jià)。具有高親和力和高特異性的包被抗體,，是決定試劑特異性的重要方面,。
1,、4 封閉,。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙[2],，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾,。
2、檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
2,、1內(nèi)源性干擾物：類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）,、黃疸等，類(lèi)風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體,，多數(shù)為IgM類(lèi)，能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng),，從而呈現(xiàn)非特異性顯色,。
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,，如用辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記物,，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色,。
2,、2 外源性干擾物,，常常因樣品采集,、貯存、處理不當(dāng)造成如樣品溶血,，被細(xì)菌污染，標(biāo)本凝集不全等,。溶血標(biāo)本,，紅細(xì)胞溶解破裂，釋放出血紅素形成,，而血紅素中的鐵卟啉是過(guò)氧化物酶的類(lèi)似物,，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色,。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP（辣根過(guò)氧化酶）[2]，有國(guó)內(nèi)報(bào)道酶免HBsAg試劑檢測(cè)溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽(yáng)性[3],。如在冰箱中保存過(guò)久,，其中的IgG可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深[2],。因此,，血標(biāo)本在采集處理時(shí)應(yīng)小心，在冰箱中保存不易過(guò)久,。
標(biāo)本凝集不全時(shí),，血清中會(huì)殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽(yáng)性,。
3,、操作過(guò)程中的問(wèn)題造成假陽(yáng)性
3,、1加樣
對(duì)于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋?zhuān)绻訕硬粶?zhǔn)就會(huì)造成誤差,，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí)，很小的誤差,，會(huì)導(dǎo)致較大的相對(duì)誤差，使陰性（或弱陽(yáng)性）標(biāo)本呈陽(yáng)性（或陰性）,。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。目前，大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本,，可較好地避免以上誤差,。
3、2洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步,，應(yīng)引起操作者重視。無(wú)論是手工操作還是機(jī)器操作,，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān),，ELISA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以消除殘留在板孔中沒(méi)能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。
3,、3 溫育
每種試劑都有其*反應(yīng)模式，其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素,。因孵育溫度高,，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)造成整板本底高,，陽(yáng)性率高,。溫育一般用濕盒或水浴，反應(yīng)板不宜疊放,，以保證各板溫度都能迅速平衡,，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋,。
3,、4酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測(cè)定結(jié)果的儀器，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,，決定結(jié)果的可靠度,。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng)，對(duì)濾光片要定期校正,；其次酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置要正確,，使用雙波長(zhǎng)，一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng),，一個(gè)參比波長(zhǎng),，以消除微孔板底部劃痕、不平,、指印或液面高度差異造成的光干擾,。此外，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)先擦試微孔板底部并壓平板條,。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同,。