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技術(shù)文章
免疫血清制備方案
點(diǎn)擊次數(shù)：3607 發(fā)布時(shí)間：2012-6-19
免疫血清的制備是一項(xiàng)常用的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),。價(jià)、高特異性的免疫血清可作為免疫學(xué)診斷的試劑（如用于制備免疫標(biāo)記抗體等）,，也可供特異性免疫治療用,。免疫血清的效價(jià)高低取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫反應(yīng)性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強(qiáng)的抗原刺激高應(yīng)答性的機(jī)體,，?？色@得價(jià)的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時(shí),，則需同時(shí)加用佐劑以增強(qiáng)抗原的免疫原性,。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此,，如欲獲得高特異性的免疫血清,，必須予先純化抗原。此外,，抗原的劑量,、免疫途徑及注射抗原的時(shí)間間隔等，也是影響免疫血清效價(jià)的重要因素應(yīng)予重視,。
具有免疫原性的抗原可刺激機(jī)體相應(yīng)B細(xì)胞增殖、分化形成漿細(xì)胞并分泌特異性抗體,。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細(xì)胞克隆所識(shí)別,，因此由某一抗原刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體，實(shí)際上為針對(duì)該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物（即多克隆抗體）,。另外,，抗體的產(chǎn)生具有回憶應(yīng)答的規(guī)律性，表現(xiàn)為初次免疫注射與再次免疫注射后的抗體應(yīng)答特點(diǎn)截然不同,。這是由于記憶性B細(xì)胞參與再次應(yīng)答所致,。
二、免疫方法
根據(jù)抗原的性質(zhì)不同而異,。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明,。
1.用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚,；
2.*次免疫：用2ml注射器吸取弗氏*佐劑（FCA）乳化的抗原（人IgG）下稱FCA-IgG）液1ml,，每側(cè)腳掌皮下各注入0.5ml,。
3.第二次免疫：間隔10-14天后，于兩側(cè)窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG,，每個(gè)淋巴結(jié)注0.1ml,，其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時(shí),，直接注入兩側(cè)窩及鼠蹊部皮下,。
4.間隔7-10天后，從耳靜脈采血0.5~1.0ml,，分離血清,，以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定免疫血清的抗體效價(jià)（即試血）。效價(jià)至少應(yīng)達(dá)到1∶16以上時(shí)才能放血,。
5.若效價(jià)未達(dá)到要求,，可用不加佐劑的抗原液（人IgG）耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次,，分別為0.1,、0.3、0.5ml,。間隔1周再試血,。如效價(jià)達(dá)到要求應(yīng)立即放血。另外,，也可在第2次免疫后,，以弗氏不*佐劑（FIA）乳化的抗原（人IgG）（簡(jiǎn)稱FIA-IgG）再免疫1-2次。注射部位,、劑量和間隔均同第2次,，再試血測(cè)抗體效價(jià)，如效價(jià)達(dá)到要求立即放血,。
（一） 心臟采用血法
1.家兔仰面，四肢縛于動(dòng)物固定架上（或由助手抓住四肢固定）,；
2.剪去左胸部兔毛,，消毒皮膚；
3.用左姆指摸到胸骨劍突處,，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟,，并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后,，以左拇指觸摸心臟搏動(dòng)zui強(qiáng)的部位,；
4.用50ml注射器（連接16號(hào)針頭），傾針45°角度,，對(duì)準(zhǔn)心搏zui強(qiáng)處刺入心臟抽血致死,；
5.將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中,，待凝固后分離血清。
（二） 頸動(dòng)脈放血法
1.家兔仰臥同上固定,。頭部略放低以暴露頸部,。剃毛及消毒皮膚,；
2.沿頸部中線切開皮膚約10cm,，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突??；
3.分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動(dòng)脈后使之游離,；
4.于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線,，分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線,。近心端的動(dòng)脈用血管夾夾?。?/div>
5.用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口,，插入塑料放血管,。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫,；
6.松開血管夾,，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80~100ml,。
四,、分離血清
將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時(shí)，再置4℃冰箱內(nèi)3~4小時(shí),。待血液凝固血塊收縮后,，用毛細(xì)滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘,，取上清加入防腐劑（0.01%硫柳汞或0.02%疊氮鈉,，zui終濃度），分裝后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/div>
五,、結(jié)果鑒定www.runwelltac.com
以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定所獲免疫血清的抗體效價(jià),，并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質(zhì)量，應(yīng)產(chǎn)生單一的沉淀弧線,。鑒定方法的具體步驟參見有關(guān)部分,。
六、材料
（一） 動(dòng)物：健康成年家兔,，雄性,，體重2~3公斤,。
（二） 器材：剪刀、鑷子,、注射器（2ml,、50ml）附針頭（9號(hào)、6號(hào)）,、稱量瓶（10ml）,、量筒、動(dòng)物固定架,、滅菌三角燒瓶（200ml）,、手術(shù)器械一套、血管夾,、黑絲線,、塑料放血管等。
（三） 試劑
1.滅菌生理鹽水,；
2.純化人IgG（10mg/ml）,；
3.消毒酒精及碘酒；
4.羊毛脂,；
5.石蠟油,；
6.活卡價(jià)苗（BCG）（75mg/ml）；
7.弗氏不*佐劑（FIA）制備：稱羊毛脂10克,，逐滴加入石蠟油40ml,，邊滴邊研磨，分裝于疫苗瓶中（每瓶10ml）,，高壓滅菌（8磅20分鐘）后保存?zhèn)溆谩?/div>
8.弗氏*佐劑乳化抗原（FCA-IgG）的制備：將FIA予溫（60℃30分鐘）,，吸取3ml于研缽中，逐滴加入活BCG（75mg/ml）0.5ml及純化人IgG2.5ml（2.4mg/ml）牨_滴入邊研磨直至形成均一性的乳狀液,，取1滴滴于冷水面上不散開為合格,。
七、注意事項(xiàng)www.runwelltac.com
1.免疫用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗體反應(yīng)性個(gè)體差異性較大,，因此免疫時(shí)至少應(yīng)選用兩只以上動(dòng)物,。另外，不能使用妊娠動(dòng)物,。
2.免疫用的抗原必須經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射,，否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的方法較費(fèi)時(shí),、費(fèi)力,。采用H-81微型振蕩混合器法或三腔管研磨法制備。前者是將抗原液與佐劑按比例混合后,，置于混合器上使之劇烈振蕩（頻率2900轉(zhuǎn)/分,，振幅6mm）,；后者是將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合后，吸入注射器內(nèi)再將注射器連接于三腔管上反復(fù)抽吸研磨,。這兩種方法約1小時(shí)即可使抗原充分乳化,。
3.佐劑一方面可提高特異性免疫反應(yīng)的效果獲得價(jià)的免疫血清，但若抗原不純時(shí),，可使抗原中極微量的污染物（0.005mgN）產(chǎn)生抗體,，以致導(dǎo)致免疫血清的純度受到影響。另外,，有些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種系對(duì)BCG過敏,，尤其是豚鼠其次是家兔，當(dāng)再次注射*佐劑時(shí),，可以引起變態(tài)反應(yīng)而導(dǎo)致免疫失敗。為此,，第二次免疫注射時(shí)應(yīng)減少佐劑中BCG的含量或改用不*佐劑,，以減少和防止變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。
4.抗原的劑量決定于抗原的種類,。對(duì)免疫原性強(qiáng)的抗原劑量應(yīng)相別較少,，免疫原性弱的抗原劑量可相對(duì)較多?？乖挠昧恳话阋泽w重計(jì)算,。在使用佐劑的情況下，一次注入的總劑量以0.5mg/kg體重為宜,。如不加佐劑時(shí)劑量可加大10倍,。另外，免疫周期長(zhǎng)者可少量多次注射,，免疫周期短者可較大量少次注射,。
5.免疫方法上也可采用多點(diǎn)注射法免疫動(dòng)物。即于家兔脊柱兩旁選4-6點(diǎn)皮下注射,，同時(shí)于兩側(cè)肩部（或臂部）和鼠蹊部各注一處,。每點(diǎn)注0.2ml，間隔2周后再于上述部位選不同點(diǎn)同上注射,，也可產(chǎn)生價(jià)的免疫血清,。
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