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技術(shù)文章
PCR疑難解決辦法總結(jié)
點擊次數(shù)：3824 發(fā)布時間：2012-3-15
PCR疑難解決辦法總結(jié)
問題1:不出現(xiàn)擴增條帶引物：引物質(zhì)量是PCR失敗或擴增條帶不理想,、容易彌散的常見原因,。對策為：①選定合適的引物合成單位,；②引物的濃度不僅要看OD值，用引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗,，應(yīng)與引物合成單位協(xié)商解決，如一條引物亮度高,，一條引物亮度低,，在稀釋引物時要平衡其濃度,；③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏而導(dǎo)致變質(zhì)降解失效,；④引物設(shè)計不合理,，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等,。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,，濃度過高可降低擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶,。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,，其PCR擴增是不會成功的,。
問題2:出現(xiàn)非特異性擴增帶 PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶,。非特異性條帶出現(xiàn)的原因：一是引物與靶序列不*互補，或引物聚合形成二聚體,；二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增,。對策為：必要時重新設(shè)計引物；減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,；降低引物量,，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù),；適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性,，65℃左右退火與延伸）。
問題3:出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,?？赡苡捎?/span>Mg2+濃度過高，退火溫度過低,，循環(huán)次數(shù)過多,，GC含量過高引起。對策為：適當(dāng)降低Mg2+濃度,；增加模板量,；減少循環(huán)次數(shù),；加入添加劑甘油或Qiagen公司的Q-solution。
問題4:污染的監(jiān)測——對照試驗 1.陽性對照：應(yīng)設(shè)有陽性對照,，它是PCR反應(yīng)是否成功,、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要標志。陽性對照要選擇擴增度中等,、重復(fù)性好,，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以重組質(zhì)粒為陽性對照,，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）,。 2.陰性對照：每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括①標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照,，被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照,；②試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA進行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染,。 3.重復(fù)性試驗 4.選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增
問題5:污染的處理（一）環(huán)境污染 1．稀酸處理法 2．紫外照射（UV）法（二）反應(yīng)液污染,，可采用下列方法之一處理： 1．DNase I法 2．內(nèi)切酶法 3．紫外照射法 4．Gama射線輻射法（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法由于UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右,，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定,。（四）固相捕獲法用于去除標本中污染的核酸和雜質(zhì)。（五）RS-PCR法（RNA-specificPCR） 也稱為鏈特異性PCR,，主要指用于RNA模板的特異性PCR法,，該法可明顯降低假陽性而不影響PCR的敏感性。（六）抗污染引物法該對引物擴增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點,，這一區(qū)域只存在于完整的原病毒中,。如果重組質(zhì)粒污染了標本，就不能擴增出任何條帶,，即使出現(xiàn)了擴增帶,，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴增,，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增帶就可以證明標本是陽性的,，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。