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技術(shù)文章
FITC熒光素標(biāo)記抗體
點(diǎn)擊次數(shù)：3245 發(fā)布時(shí)間：2011-6-27
FITC熒光素標(biāo)記抗體
當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應(yīng)時(shí),，主要是蛋白質(zhì)上賴(lài)氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵（thiocarbmide）結(jié)合,，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物,。一個(gè)IgG分子中有86個(gè)賴(lài)氨酸殘基,，一般zui多能結(jié)合15～20個(gè)，一個(gè)IgG分子可結(jié)合2～8個(gè)分子的FITC,，其反應(yīng)式如下：
FITC-N=C=S + N-H2-蛋白質(zhì) → FITC-NS-C-N-H2-蛋白質(zhì)
常用Marsshall（1958）法標(biāo)記熒光抗體,，也可以根據(jù)條件采用Chadwick等標(biāo)記法或Clark等（1963）的透析標(biāo)記法。
1.Marsshall法
（1）材料：抗體球蛋白溶液,、0.5mol／L（pH9.0）碳酸鹽緩沖液,、無(wú)菌生理鹽水,、異硫氰酸熒光素、1％硫柳汞水溶液,、50ml小燒杯,、4℃冰箱、電磁攪拌器,、透析袋,、玻棒、pH7.2或3.0的0.01mol／LPBS等,。
（2）方法及步驟
①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中,，再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后免疫球蛋白濃度為20mg／ml,，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1／10，混勻,，將燒瓴置電磁攪拌器上（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min,。
②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加0.01mg熒光色素,，用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取所需的異硫氰酸熒光素粉末,。也可用下述公式計(jì)算出免疫球蛋白、熒光素的量,，還可以算出需加緩沖液的量,。
a.蛋白溶液：含量Amg／m1；容積Bml,。
b.總蛋白量（AXB）＝Crag,。
c.C／20～C／10＝Dmg（如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10,；如高于20mg／ml,，用C／20）。
d.熒光素FITC的量：（1／50～2／100）XC＝Emg,。
e.巳0.5mol／L（pH9.5）碳酸鹽緩沖液D／10＝Fml,。
f. PBS量D-（B+F）=Gml。
注：A為蛋白含量,，mg／ml,；B為蛋白質(zhì)溶液的容積；C為蛋白總量,，mg,；D為常數(shù)，mg,；正為熒光素的量,，mg,；F為碳酸鹽緩沖液的容積，ml,；G為PBS的容積,，ml。
③結(jié)合（或標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱(chēng)取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,，避免將熒光素粘于燒瓶壁（大約在5—10min內(nèi)加完）,，加完后，繼續(xù)避光攪拌12h左右,。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析：結(jié)合完畢后,，將標(biāo)記的球蛋白溶液離心（2500r／min）20rain,，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中,，再置于燒杯中,，用pH8.0緩沖鹽水透析（0～4~C）過(guò)夜。
⑤過(guò)柱：取透析過(guò)夜的標(biāo)記物,，通過(guò)葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱,，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定,。洗脫液：0.01mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）,；過(guò)濾量：12ml標(biāo)記蛋白液（過(guò)濾前未透析）；收集量：20ml（稀釋1.7倍左右）,。
2.Chadwick法
（1）試劑和材料：抗體球蛋白溶液,、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液,、0.01mol/L pH8.0PBS,、1%硫柳汞、離心機(jī)及離心管,、燒杯（25ml）攪拌器,、無(wú)菌吸管，無(wú)菌吸管及毛細(xì)滴管,、燒杯（500ml）透析袋等,。
（2）方法及步驟
①抗體準(zhǔn)備：用o～4~C的pH8。0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg／ml,，置入25ml燒杯內(nèi),，放于冰槽中。
②熒光色素準(zhǔn)備：按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0.01rug計(jì)算，稱(chēng)取所需的熒光素,，用3％碳酸鈉水溶液溶解,。
③將準(zhǔn)備的抗體與熒光色素溶液等量混合，充分?jǐn)噭?，在o～4~C冰箱中結(jié)合（在磁力攪拌機(jī)上持續(xù)攪拌）18～24h,。
④透析和柱層析：方法同Marsshall法。
3.改良法
（1）試劑和材料
①0.01mol／L（pH7.2）PBS配法中,，校定pH至7.2,。NaCi 18g、Na2HP04 1.15g,，溶于2000ml蒸餾水
②0.5mol／L（pH9.0）碳酸鹽緩沖液配法 取0.5mol／LNazCOs（5.3％）10ml加入0.5mol／LNaHC03（4.2％）90ml,，混合后，校定pH至9.0,。
③3％碳酸鈉水溶液配法 稱(chēng)L 5g無(wú)水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成,。
④其他試劑和材料 l％*、離心機(jī)及離心管,、燒杯（25m1）,、攪拌器、無(wú)菌吸管及毛細(xì)滴管,、燒杯（500m1）透析袋等。
（2）方法及步驟
①取價(jià)的抗人球蛋白兔免疫血清,，分離球蛋白,，用鹽水（0.15mol／LNaCl）及緩沖液（0.5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9.0）稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白質(zhì)lOmg,，緩沖液為總量的10％,，降溫至4℃。
②加入異硫氰酸鹽（FITC）熒光素[蛋白：熒光素＝（50—80）mg/mg],，在0～4℃,。
下電磁攪拌12～14h。
③然后用半飽和的硫酸銨將標(biāo)記球蛋白沉淀分離,，除去未結(jié)合的熒光素,，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨（用Nessler試劑測(cè)驗(yàn),，至隔夜透析的鹽水無(wú)氨離子及熒光色素為止）,。
④將制備好的熒光抗體加*o.01％，分裝在lml安瓿中,，或凍干,，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，一20~C保存可達(dá)2年以上。
4.透析標(biāo)記法
此法適用于小量抗體的熒光素標(biāo)記,，標(biāo)記簡(jiǎn)便,，非特異性染色較少。
（1）試劑和材料：試劑和材料同改良法,。
（2）方法及步驟
①用0.025mol／L碳酸鹽緩沖液pH9.0,，將欲標(biāo)記免疫球蛋白稀釋成1％濃度，裝入透析袋中,。
②用同一緩沖液將FITC配成0.1mg／ml的溶液,，按10mg／ml球蛋白溶液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi),，并使透析袋浸沒(méi)于FITC液中,。
③容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒,，在4~C電磁攪拌下透析標(biāo)記24h,。取出透析袋中標(biāo)記液，即刻用SephadexG50凝膠過(guò)濾,，去除游離熒光素,，分裝，貯存于4℃中,。