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技術文章
碘克沙醇梯度溶液分離細胞核
點擊次數：4359 發(fā)布時間：2011-1-18
碘克沙醇梯度溶液分離細胞核
用碘克沙醇梯度溶液從哺乳動物肝臟中分離細胞核 www.elisa17.com
試劑和器材：
1. OptiPrepTM（600g碘克沙醇,，ρ=1.32g/ml）,；
2. OptiPrepTM稀釋劑（OptiPrepTM diluent，OD）：150mmol/L KCl,、30mmol/L MgCl2,、120mmol/L*基甘氨酸-KOH，pH7.8,；
3. 勻漿介質（HM）：0.25mol/L蔗糖,、25mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2,、20mmol/L*基甘氨酸-KOH,，pH7.8；按要求向OptiPrepTM稀釋劑和勻漿介質中加入蛋白酶抑制劑
4. 高轉矩橋式電動機（半導體開關控制）,；
5. Potter-Elvehjem勻漿器,，20—40ml，孔隙約0.07mm,；
6. 高速離心機,，帶可容納15—50ml離心管的吊桶式轉子；
7. 注射器,，帶金屬套管針（內徑約0.8mm）,；
8. 尼龍濾網,；
1. OptiPrepTM（600g碘克沙醇,，ρ=1.32g/ml）,；
2. OptiPrepTM稀釋劑（OptiPrepTM diluent，OD）：150mmol/L KCl,、30mmol/L MgCl2,、120mmol/L*基甘氨酸-KOH，pH7.8,；
3. 勻漿介質（HM）：0.25mol/L蔗糖,、25mmol/L KCl、5mmol/L MgCl2,、20mmol/L*基甘氨酸-KOH,，pH7.8；按要求向OptiPrepTM稀釋劑和勻漿介質中加入蛋白酶抑制劑
4. 高轉矩橋式電動機（半導體開關控制）,；
5. Potter-Elvehjem勻漿器,，20—40ml，孔隙約0.07mm,；
6. 高速離心機,，帶可容納15—50ml離心管的吊桶式轉子；
7. 注射器,，帶金屬套管針（內徑約0.8mm）,；
8. 尼龍濾網,；
實驗方法：
所有操作在0—4℃下進行。
1. 制備500g/L碘克沙醇工作液：每5倍體積OptiPrepTM用1倍體積的OptiPrepTM稀釋劑來稀釋,；
2. 梯度溶液：用勻漿介質（分別為6倍體積+4倍體積和7倍體積+3倍體積）來稀釋500g/L碘克沙醇工作液以制備300g/L和350g/L的兩種碘克沙醇梯度溶液,。保持于冰上。
3. 切除肝臟并用剪刀剪切成微小碎塊,；
4. 將大約一半肝臟轉移到Potter-Elvehjem勻漿器的20ml勻漿介質中,，并用研杵研磨約8次，在約500r/min轉速下旋轉以破碎組織,；
5. 對另一半肝臟切碎物重復以上操作,；
6. 用尼龍濾網過濾；
7. 通過與等體積的500g/L碘克沙醇工作液混合將勻漿液調整到250g/L碘克沙醇,；
8. 將10—15ml勻漿液轉移到50ml管中,，從300g/L和350g/L的碘克沙醇梯度溶液中各取10ml加到勻漿液之下；
9. 在100000g下離心20min,；
10. 細胞核在300g/L和350g/L碘克沙醇界面上成帶,，用注射器和金屬套管針吸取細胞核；
11. 用2倍體積的勻漿介質稀釋懸液,，在2000g下離心10min沉淀細胞核,；
所有操作在0—4℃下進行。
1. 制備500g/L碘克沙醇工作液：每5倍體積OptiPrepTM用1倍體積的OptiPrepTM稀釋劑來稀釋,；
2. 梯度溶液：用勻漿介質（分別為6倍體積+4倍體積和7倍體積+3倍體積）來稀釋500g/L碘克沙醇工作液以制備300g/L和350g/L的兩種碘克沙醇梯度溶液,。保持于冰上。
3. 切除肝臟并用剪刀剪切成微小碎塊,；
4. 將大約一半肝臟轉移到Potter-Elvehjem勻漿器的20ml勻漿介質中,，并用研杵研磨約8次，在約500r/min轉速下旋轉以破碎組織,；
5. 對另一半肝臟切碎物重復以上操作,；
6. 用尼龍濾網過濾；
7. 通過與等體積的500g/L碘克沙醇工作液混合將勻漿液調整到250g/L碘克沙醇,；
8. 將10—15ml勻漿液轉移到50ml管中,，從300g/L和350g/L的碘克沙醇梯度溶液中各取10ml加到勻漿液之下；
9. 在100000g下離心20min,；
10. 細胞核在300g/L和350g/L碘克沙醇界面上成帶,，用注射器和金屬套管針吸取細胞核；
11. 用2倍體積的勻漿介質稀釋懸液,，在2000g下離心10min沉淀細胞核,；