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細(xì)胞支原體污染的熒光檢測(cè)方法
點(diǎn)擊次數(shù)：1522 發(fā)布時(shí)間：2016-9-14
DNA螢光染色法
· 原理︰利用螢光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測(cè)支原體污染,。此染劑會(huì)結(jié)合到DNA之Adenosine-Thymidine （A-T） rich區(qū)域，因?yàn)橹гw之DNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%）,，所以可將其染色而偵測(cè),。被支原體污染之細(xì)胞經(jīng)染色后,，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點(diǎn)，即為支原體之DNA,，證明有支原體之污染,。
· 特點(diǎn)︰簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)與靈敏,，廣泛使用,，可作為例行之偵測(cè)步驟?？梢詡蓽y(cè)不易培養(yǎng)之支原體,，例如M. hyorhinis，較直接培養(yǎng)法快,，約一星期即可知道結(jié)果,。
· 缺點(diǎn)：有時(shí)仍會(huì)有螢光背景，影響判讀,。
步驟：
· 取出培養(yǎng)之Vero細(xì)胞,，吸除培養(yǎng)液。于每個(gè)well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液,，靜置10 min后,，吸除固定液,用PBS洗滌三次。
· 于每個(gè)well中,，加入1 ml Hoechst 33258 working solution,，室溫下靜置5-10 min。
· 吸掉Hoechst 33258染液后,，以無(wú)菌水洗滌3次，風(fēng)干后加入1滴的封片劑,，并以蓋玻片覆蓋之,。
· 以100x-400x螢光顯微鏡觀察。觀察細(xì)胞核外是否有藍(lán)色螢光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)之螢光物產(chǎn)生,。
結(jié)果判讀︰
若有支原體污染,，在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)或是絲狀點(diǎn)。其形狀一致,，與細(xì)胞殘片染成之不規(guī)則點(diǎn)狀物不同,。其螢光可維持?jǐn)?shù)星期。
negative result : 螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核,，測(cè)試樣品沒(méi)有支原體的污染,。（為positive result : 在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn)，表示測(cè)試樣品有支原體的污染,。
Negative result
螢光顯微鏡下,，只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核，測(cè)試樣品沒(méi)有支原體的污染,。