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技術(shù)文章
原代細(xì)胞DNA與RNA的吖啶橙熒光染色法
點擊次數(shù)：3063 發(fā)布時間：2010-10-15
原代細(xì)胞DNA與RNA的吖啶橙熒光染色法
基本原理：
吖啶橙（acridine orange，AO）是一種常用熒光染料,，吖啶橙與原代細(xì)胞內(nèi)的DNA,、RNA都有親和力，但有一定的特異性,，即結(jié)合后發(fā)不同顏色的熒光,，DNA呈亮綠色，而RNA呈橘紅色至火紅色,。此法簡便快捷,，既可染活原代細(xì)胞又可染固定原代細(xì)胞。用于直接染色觀察活原代細(xì)胞或固定染色觀察原代細(xì)胞均可,。吖啶橙對活原代細(xì)胞毒性小,，配成1×10-4—2×10-4可用于直接染色活原代細(xì)胞和進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，但不持久,，用固定染色觀察法效果更好。
材料：
1. 蓋片單層培養(yǎng)原代細(xì)胞,；
2. 固定劑：95%乙醇或乙酸/甲醇（現(xiàn)配）,；
3. 吖啶橙：用生理鹽水配成1%的干液。使用時再用PBS稀釋成1×10-4—2×10-4mol/L pH4.5—5.0的染色液,；
4. 0.1mol/L的CaCl2,；
5. 1%乙酸；
染色步驟：
1. 將蓋片單層培養(yǎng)原代細(xì)胞從瓶中取出,，立即用溫Hanks液漂洗3—5s,，以去除培養(yǎng)基中血清；
2. 投入95%乙醇或乙酸/甲醇固定15—30min,，用濾紙接觸蓋片邊緣,，蓋片微干；
3. 用1%乙酸酸化30s,；
4. 用1×10-4—2×10-4的吖啶橙染液染色30s或1min,；
5. 用0.1mol/L的CaCl2處理30s—2min；
6. PBS漂洗3次,，每次數(shù)秒,；
7. PBS封片，熒光顯微鏡下直接觀察并拍照,；
8. 注意事項：觀察中應(yīng)隨時填加PBS以避免標(biāo)本干涸,。如用油浸鏡觀察，需再覆以大蓋片蓋在附有原代細(xì)胞蓋片上,，保證原代細(xì)胞面朝上,，用無熒光性油浸鏡觀察,。原代細(xì)胞蓋片標(biāo)本在95%乙醇中能保存數(shù)日后仍可觀察，如退色,，再用AO染色,。鏡下觀察，DNA呈翠綠色,，RNA呈火紅色,。
結(jié)果：
原代細(xì)胞核因含DNA呈綠色，細(xì)胞質(zhì)及核仁因含RNA呈紅色,；