脫氣流動(dòng)相脫氣對(duì)于避免HPLC系統(tǒng)出問(wèn)題，順利得到一個(gè)理想的數(shù)據(jù)是一個(gè)很有效的措施,。HPLC系統(tǒng)內(nèi)是不能夠有氣泡存在的,。HPLC泵在輸送液體時(shí)要產(chǎn)生很大的壓力,，由于氣體的壓縮比與液體相比大的多，因而當(dāng)氣泡存在時(shí),，你將觀察到瞬間的流速降低和系統(tǒng)壓力下降,。如果這個(gè)氣泡足夠大，液相泵將不能輸送任何溶劑,，而且如果壓力低于預(yù)先設(shè)定的壓力低限,，泵將停止工作。有些泵設(shè)計(jì)可以很好地排除氣泡,，而也有一些泵設(shè)計(jì)當(dāng)氣泡存在時(shí)將停止運(yùn)轉(zhuǎn),。當(dāng)一個(gè)氣泡通過(guò)輸液泵時(shí),，由于系統(tǒng)壓力大,，氣泡通常會(huì)溶解在流動(dòng)相溶液中，隨流動(dòng)相通過(guò)柱子,。但是到達(dá)檢測(cè)器流通池時(shí)系統(tǒng)壓力又恢復(fù)到了大氣壓,，因而氣泡可能在檢測(cè)器流通池中又顯現(xiàn)，在色譜圖上會(huì)出現(xiàn)不規(guī)律的毛刺,。為解決這個(gè)問(wèn)題,，有些儀器公司設(shè)計(jì)一個(gè)反壓控制器，這樣可以在檢測(cè)器出口提供足夠的壓力保持氣泡始終溶解在流動(dòng)相中直到它們流出檢測(cè)器,。當(dāng)然,，這個(gè)壓力不能超過(guò)流通池所能承受的壓力極限，否則可能損壞檢測(cè)器,。紫外/可見(jiàn)光（UV/VIS）檢測(cè)器的液相色譜圖中的噪音毛刺通常是氣泡進(jìn)入并通過(guò)流通池的征兆,。有些檢測(cè)器對(duì)空氣的存在也非常敏感，但表現(xiàn)出的征兆與UV/VIS不同,，例如有報(bào)導(dǎo)說(shuō),，當(dāng)使用熒光（FL）檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相中溶解氧的存在可能會(huì)使一些化合物失去熒光性,。此外,，對(duì)于利用待測(cè)物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)引起電流變化而進(jìn)行檢測(cè)的電化學(xué)（EC）檢測(cè)器，對(duì)流動(dòng)相中的溶解氧的存在也非常靈敏,。此外,，氣泡的存在有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間不重現(xiàn)。所以,，必須注意消除流動(dòng)相中的空氣,，并且還應(yīng)避免空氣由管路（如PTFE管）滲透進(jìn)流動(dòng)相中。如果適當(dāng)?shù)仃P(guān)注在使用之前脫去流動(dòng)相中溶解進(jìn)的空氣,，上述這些問(wèn)題均能避免,，或把影響降至zui低,。常用的脫氣方法有如下幾種：1. 吹氦脫氣法。利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性,，在0.1MPa壓力下,，以約60 mL/min流速通入流動(dòng)相儲(chǔ)液容器中10～15min，可以很有效地從流動(dòng)相中排除溶解的空氣,，能排除接近80%的氧氣,。采用一個(gè)分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動(dòng)相中將等體積的幾乎全部氣體排除,。這意味著1L氦氣通過(guò)1L流動(dòng)相就可完成排氣這個(gè)工作,。這種脫氣方法雖然好，但我們國(guó)內(nèi)氦氣價(jià)格較高,，很少有實(shí)驗(yàn)室采用此方法,。2. 加熱回流法。此法的脫氣效果較好,。在操作時(shí)要注意冷凝塔的冷卻效率,，否則溶劑會(huì)丟失，混合流動(dòng)相的比例會(huì)有變化,。3. 抽真空脫氣法,。此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa即可除去溶解的氣體,。但是由于真空脫氣會(huì)使混合溶劑組成發(fā)生變化,，從而影響到實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性，因此多用于單溶劑體系的簡(jiǎn)單分析,。4. 超聲波脫氣法,。將欲脫氣的流動(dòng)相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min,。此法的脫氣效果zui差,。5. 在線脫氣法。現(xiàn)在商品的HPLC儀器,，均可配在線脫氣機(jī),。在線脫氣使用簡(jiǎn)單，低故障,，有效,。建議購(gòu)買儀器時(shí)一定要購(gòu)買，有的公司是作為選購(gòu)件,，所以與儀器公司談配置時(shí)應(yīng)與公司確認(rèn),。過(guò)濾任何顆粒物進(jìn)入HPLC系統(tǒng)后都會(huì)在柱子入口端被篩板擋住，zui后的結(jié)果是將柱子堵塞,，表現(xiàn)出的特征是系統(tǒng)壓力增加并使色譜峰變形,。因此,，要采取各種預(yù)防措施，包括操作步驟和商品儀器自身的各種過(guò)濾設(shè)計(jì),，努力防止或減少顆粒物進(jìn)入HPLC系統(tǒng)中,，從而延長(zhǎng)儀器和色譜柱的使用壽命，并提高數(shù)據(jù)的可靠性,。在HPLC系統(tǒng)中,，顆粒物的主要來(lái)源有三個(gè)途徑：流動(dòng)相、被測(cè)樣品和儀器系統(tǒng)部件的磨損物,?！鲃?dòng)相如果流動(dòng)相均由液相色譜級(jí)溶劑組成，流動(dòng)相沒(méi)有必要過(guò)濾,。這是因?yàn)橐合嗌V級(jí)的有機(jī)溶劑,，例如乙腈、甲醇等,，在制造的工藝過(guò)程中都已經(jīng)過(guò)了0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾,。同樣的,，無(wú)論你是買的HPLC級(jí)的水還是在實(shí)驗(yàn)室使用超純水凈化系統(tǒng)制備的水,，zui后一步也是通過(guò)0.2 μm微孔濾膜。然而,，如果有任何一種緩沖液中加入了固體物,，例如磷酸鹽，流動(dòng)相過(guò)濾將是必要的一個(gè)步驟,。雖然緩沖鹽可能是可溶解的,、高純的，但它還是可能含有顆粒物質(zhì),，例如在蓋試劑瓶的塑料內(nèi)蓋時(shí),，塑料瓶蓋子與瓶口邊緣擠壓就會(huì)產(chǎn)生塑料顆粒。在這種情況下,，添加的一種固體物可能*溶解了,，但是少量雜質(zhì)顆粒存在于流動(dòng)相中成為殘?jiān)Ａ鲃?dòng)相通過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾對(duì)于從流動(dòng)相中除去所有顆粒物是一個(gè)有效方法,。0.2 μm微孔濾膜也可以用,，但是它們就這個(gè)應(yīng)用而言并不比0.45μm微孔濾膜更有效，而且它的過(guò)濾速度會(huì)更慢,，特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)室使用的試劑和水的質(zhì)量不太好時(shí),。建議實(shí)驗(yàn)室在編寫制定流動(dòng)相制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOPs）時(shí)，可以借鑒上同類實(shí)驗(yàn)室的規(guī)定,，即：流動(dòng)相制備僅采用HPLC級(jí)液體時(shí)不需要過(guò)濾,，反之所有流動(dòng)相組成在使用前必須過(guò)濾,。在連接儲(chǔ)液瓶和泵的輸液管的末端入口采用下沉式過(guò)濾器（常見(jiàn)材質(zhì)有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種）也是很重要的。這個(gè)過(guò)濾器的規(guī)格為≥10 μm的微孔物質(zhì),，所以它不能取代流動(dòng)相過(guò)濾步驟,，但是它能除去系統(tǒng)中的塵土并保證儲(chǔ)液瓶、輸液管使用的可靠性,?！粶y(cè)樣品液相系統(tǒng)中的第二個(gè)顆粒物來(lái)源是被測(cè)樣品。一些實(shí)驗(yàn)室在將他們的樣品放置在自動(dòng)進(jìn)樣器盤（或手動(dòng)進(jìn)樣）以前,，所有樣品都先通過(guò)一個(gè)0.45 μm針筒式過(guò)濾器過(guò)濾,。這是一個(gè)有效除去被測(cè)樣品中顆粒物的方法。但是這個(gè)過(guò)程也有一點(diǎn)需要關(guān)注：你使用了針筒式過(guò)濾器就不可能100%得到通過(guò)過(guò)濾器的被測(cè)樣品,，總會(huì)有或多或少的丟失,。丟失來(lái)自這樣幾方面：過(guò)濾器濾膜的吸附、過(guò)濾器濾出的顆粒物上的吸附,、針筒式濾膜過(guò)濾器與針筒連接處的滲漏等,。如果有丟失，過(guò)濾后液體中被測(cè)物的含量或濃度與原基本樣液的含量或濃度還相同嗎,？這個(gè)問(wèn)題一般需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)確認(rèn),。確認(rèn)這步是要增加工作量和費(fèi)用的。過(guò)濾器的使用是一種消耗,，每個(gè)過(guò)濾器的價(jià)格從幾元到十幾元,。但在做食品中殘留物分析時(shí)，由于基質(zhì)大多比較復(fù)雜,，所以過(guò)濾這步已成為*的一步,。在實(shí)際分析工作中，一般檢測(cè)每一組樣品會(huì)帶一個(gè)外標(biāo),、一個(gè)添加回收或是質(zhì)控樣品,，所以，只要zui終檢測(cè)時(shí)得到的信噪比能滿足檢出限要求,，可將這步視為系統(tǒng)誤差而忽略,。▲儀器系統(tǒng)部件的磨損物zui后,，在HPLC系統(tǒng)中顆粒物的另一個(gè)主要來(lái)源是輸液泵密封墊和進(jìn)樣閥旋轉(zhuǎn)軸的磨損,。關(guān)于輸液泵密封墊的磨損更換有兩種不同建議。*種建議認(rèn)為,，在一般實(shí)驗(yàn)室中輸液泵密封墊通常使用壽命為六個(gè)月到一年,，因此建議半年或一年更換這些密封墊，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)基于上述觀點(diǎn)制定定期預(yù)防性維護(hù)計(jì)劃,。該觀點(diǎn)認(rèn)為：與輸液泵密封墊顆粒堵塞柱子而更換新柱子的費(fèi)用相比,，更換密封墊的費(fèi)用低些,。一些輸液泵有玻璃砂芯或篩網(wǎng)，可在流路中濾掉從泵密封墊磨損下來(lái)的顆粒物,，防止這些顆粒物隨流動(dòng)相流至柱頭,。若有這種裝置應(yīng)查閱輸液泵操作手冊(cè)，查看推薦的這種過(guò)濾器清洗或更換的間隔,。另一種建議則認(rèn)為,，原裝密封墊的密封效果，更換以后容易引起流動(dòng)相滲漏,。所以,，只要不漏液就不要輕易更換密封墊。兩種說(shuō)法都有其道理,，具體如何操作,，建議與儀器公司工程師溝通，各公司的儀器還是有些不同的,。自動(dòng)進(jìn)樣器旋轉(zhuǎn)軸的密封隨著使用時(shí)間也會(huì)磨損,，即便是高負(fù)荷的運(yùn)轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)軸密封墊也可以使用幾年。如果你的自動(dòng)進(jìn)樣器系統(tǒng)有計(jì)數(shù)進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)動(dòng)次數(shù)的功能,，你可以設(shè)定一個(gè)警鈴當(dāng)預(yù)設(shè)閥轉(zhuǎn)動(dòng)次數(shù)已達(dá)到時(shí)提醒你,。曾有一種說(shuō)法，進(jìn)樣器zui多轉(zhuǎn)動(dòng)20,000次,，這僅僅是進(jìn)樣10000個(gè),；但這似乎不是實(shí)驗(yàn)室涉及的常規(guī)樣品分析使用壽命,，它們的實(shí)際使用壽命會(huì)更長(zhǎng),。旋轉(zhuǎn)軸密封磨損后會(huì)滲液，比較明顯的特征是同一樣品多次進(jìn)樣后,，峰面積值差別比較大（RSD>5%）,。當(dāng)然，輸液泵的密封墊和旋轉(zhuǎn)軸的密封墊磨損將增加更多研磨物在流動(dòng)相中,，加速對(duì)這些部件的損傷,。此外，如果你日常運(yùn)行的流動(dòng)相有緩沖鹽,，如磷酸緩沖鹽,，密封墊的磨損會(huì)更快。無(wú)論顆粒物源于何物,，實(shí)驗(yàn)時(shí)都要將其除去,。推薦在HPLC系統(tǒng)中采用一個(gè)0.45或0.5 μm的在線多孔過(guò)濾器，接在自動(dòng)進(jìn)樣器和柱子之間,，即使已使用了保護(hù)柱,。這個(gè)在線過(guò)濾器將成為擋板代替柱頭的濾板,，而且如采用一個(gè)玻璃砂芯濾板，既便宜,，更換又方便（幾分鐘就可更換）,。若采用在線過(guò)濾，HPLC系統(tǒng)檢測(cè)每批樣品開(kāi)始前記錄下壓力值,，當(dāng)壓力上升一定值,，例如25%或增加500psi，應(yīng)該更換玻璃砂芯濾板了,，更換以后沖洗幾分鐘系統(tǒng)將恢復(fù)到原來(lái)的壓力值,。沖洗使HPLC系統(tǒng)良好運(yùn)行的第三個(gè)要點(diǎn)是保持系統(tǒng)的清潔。你需要關(guān)注流動(dòng)相流經(jīng)該系統(tǒng)的所有地方,，對(duì)于這些地方經(jīng)常性的沖洗,，將使你的系統(tǒng)保持在“Ready"狀態(tài)?！鲃?dòng)相儲(chǔ)液瓶首先要經(jīng)常清洗流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶,，或者每做一批新樣品更換一次流動(dòng)相。一個(gè)臟的儲(chǔ)液瓶將會(huì)污染注入的流動(dòng)相,。建議儲(chǔ)液瓶中緩沖液使用時(shí)間不要超過(guò)一周,，而有機(jī)溶劑使用時(shí)間不要超過(guò)一個(gè)月。也有人建議儲(chǔ)液瓶中保持用溶劑充滿,，直到更換分析方法儲(chǔ)液瓶需更換新溶劑（流動(dòng)相組成發(fā)生變化）時(shí),，將舊溶劑倒掉更換新溶劑，這樣勝于將溶劑用完,。但這對(duì)于分析樣品量少的實(shí)驗(yàn)室而言似乎有些浪費(fèi),。儀器公司的工程師建議儲(chǔ)水瓶的水要天天換，每周瓶子還應(yīng)該用異丙醇清洗一次,。有的實(shí)驗(yàn)室則在水里加入0.1～1 mM的甲酸抑制微生物的生長(zhǎng),。這些做法看起來(lái)有些繁瑣，但卻能起到“磨刀不誤砍柴工"作用,。 ▲泵接下來(lái)要沖洗的是泵,。千萬(wàn)不要一分析完沖幾分鐘后就停泵，特別是當(dāng)流動(dòng)相中含有難揮發(fā)的緩沖液（如磷酸鹽）時(shí),。如果儀器不是連續(xù)使用,，當(dāng)流動(dòng)相蒸發(fā)時(shí)，難揮發(fā)物就會(huì)粘在活塞密封墊的表面,，難揮發(fā)物將形成固形物沉淀,。這是泵密封墊磨損和單向閥滲漏的主要原因之一。所以，無(wú)論使用長(zhǎng)短,，在停泵以前一定要用非緩沖液流動(dòng)相沖洗泵在半個(gè)小時(shí)以上,，要是流動(dòng)相中有難揮發(fā)緩沖鹽則建議沖洗的時(shí)間應(yīng)該更長(zhǎng)些?！詣?dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器也要按規(guī)定清洗?，F(xiàn)在的儀器多配有自動(dòng)進(jìn)樣器的沖洗液瓶，通常只要注意及時(shí)更換,、補(bǔ)充沖洗液即可,。自動(dòng)進(jìn)樣器用的洗滌液也要采用與流動(dòng)相相同的方式處理，并根據(jù)溶劑的有效期和規(guī)定,，清洗儲(chǔ)液瓶或更換洗滌液?，F(xiàn)在的自動(dòng)進(jìn)樣器設(shè)置、操作都很簡(jiǎn)單,，如果時(shí)間允許（特別是利用夜間運(yùn)行）,，每次分析完后設(shè)置進(jìn)1、2針純?nèi)軇ㄈ缂状?、乙腈）,，也是一個(gè)好做法。 ▲色譜柱 對(duì)柱子的污染是隨使用時(shí)間而增加,。通常表現(xiàn)是：運(yùn)行走基線時(shí)在記錄的色譜圖中基線噪音增加,，泵壓也增加。解決這個(gè)問(wèn)題的zui有效方法就是在每一批樣品分析結(jié)束后或準(zhǔn)備卸下柱子時(shí)用大量的流動(dòng)相沖洗柱子（例如,，甲醇,、乙腈和水）。用梯度沖洗效果更好,，具體的比例要根據(jù)柱子的說(shuō)明書和性質(zhì)而定,。 ▲檢測(cè)器如果是正常使用，檢測(cè)器將依據(jù)其性質(zhì)并按照說(shuō)明書規(guī)定進(jìn)行洗,。例如UV/VIS檢測(cè)器或FL檢測(cè)器,，在對(duì)柱子和系統(tǒng)進(jìn)行沖洗時(shí)也就一同對(duì)檢測(cè)器流通池中污染物進(jìn)行了清洗。但是蒸發(fā)光檢測(cè)器或質(zhì)譜儀則需要按照說(shuō)明書進(jìn)行定期清洗,。這些檢測(cè)器在使用時(shí)會(huì)有難揮發(fā)污染物沉積，如質(zhì)譜儀離子源的噴針,、毛細(xì)管,、錐孔板、預(yù)四極等部件,，因而需要定期清洗,。而且對(duì)聯(lián)有這些檢測(cè)器的系統(tǒng)沖洗時(shí)，與這些檢測(cè)器斷開(kāi)，以減少對(duì)檢測(cè)器的污染,?？傊瑢?shí)驗(yàn)室日常使用的液相色譜儀要是能認(rèn)真做好這三項(xiàng)工作——脫氣,、過(guò)濾和沖洗,，你的儀器可以得到良好的預(yù)防性維護(hù)，使用時(shí)就會(huì)感到比較順手,。當(dāng)然,，在實(shí)際操作時(shí)遇到的問(wèn)題并沒(méi)有這么簡(jiǎn)單，但這三個(gè)良好習(xí)慣將是正確操作,、使用HPLC系統(tǒng)的基礎(chǔ),。
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