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分光光度計(jì)的原理和用途分光光度計(jì)特點(diǎn)　　1,、采用高性能光柵,，波長(zhǎng)精度更高；　　2,、采用進(jìn)口鎢燈,，發(fā)光效率高，使用壽命長(zhǎng),，功耗降低,；　　3、超大規(guī)模集成,，T/A轉(zhuǎn)換精度高,，穩(wěn)定性高；　　4,、微機(jī)系統(tǒng)的應(yīng)用,，使操作使用簡(jiǎn)單可靠。 分光光度計(jì)描述　　分光光度法則是通過(guò)測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸收度,，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析,。常用的波長(zhǎng)范圍為：(1)200～400nm的紫外光區(qū)(2)400～760nm的可見(jiàn)光區(qū),(3)2.5～25μm（按波數(shù)計(jì)為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計(jì),、可見(jiàn)光分光光度計(jì)（或比色計(jì)）,、紅外分光光度計(jì)或原子吸收分光光度計(jì)。為保證測(cè)量的精密度和準(zhǔn)確度,，所有儀器應(yīng)按照國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定,，定期進(jìn)行校正檢定。 分光光度計(jì)工作原理　　分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源,，通過(guò)系列分光裝置,，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光源透過(guò)測(cè)試的樣品后,，部分光源被吸收,，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比,。　　單色光輻射穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí),，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(zhǎng)度）成正比,，其關(guān)系如下式：　　A=-log(I/I。)=-lgT=kLc　　式中 :A 為吸光度,；　　I,。為入射的單色光強(qiáng)度,；　　I 為透射的單色光強(qiáng)度；　　T 為物質(zhì)的透射率,；　　k 為摩爾吸收系數(shù),；　　L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長(zhǎng)　　c 為物質(zhì)的濃度　　物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng),，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù),。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測(cè)定其吸收度,即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量,。在可見(jiàn)光區(qū),，除某些物質(zhì)對(duì)光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒(méi)有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過(guò)處理使其顯色后再測(cè)定,故又稱(chēng)比色分析,。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多,，且常使用單色光純度較差的儀器，故測(cè)定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r(shí)操作,。 分光光度計(jì)用途　　核酸的定量　　核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率zui高的功能,。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,，單鏈,、雙鏈DNA,，以及RNA,。核酸的zui高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類(lèi)型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù),。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig,。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測(cè)試前,，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積,，爾后測(cè)試空白液和樣品液,。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者zui頭痛的問(wèn)題,。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大?！　∈聦?shí)上,，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度,。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),，都是正常的,。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測(cè)試時(shí),，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果,。為了zui大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值在0.1-1.,。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小,，結(jié)果穩(wěn)定,。從而意味著樣品的濃度不能過(guò)低，或者過(guò)高（超過(guò)光度計(jì)的測(cè)試范圍）,。zui后是操作因素,，如混合要充分，否則吸光值太低,，甚至出現(xiàn)負(fù)值,；混合液不能存在氣泡，空白液無(wú)懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大,；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯,；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的zui小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)?！　〕撕怂釢舛?，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值,，用于評(píng)估樣品的純度,，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品,，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類(lèi)物質(zhì)的影響,。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物，多肽,，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子,。純樣品,，A320一般是0?！　〉鞍踪|(zhì)的直接定量（UV法）　　這種方法是在280nm波長(zhǎng),，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg 公式,，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應(yīng)的換算方法,，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液,，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì),。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的“背景”信息,，設(shè)定此功能“開(kāi)”,。與測(cè)試核酸類(lèi)似，要求A280的吸光值至少大于0.1A,，*的線性范圍在1.0-1.5 之間,。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”,。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象,。事實(shí)上,，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過(guò)1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定,。漂移的原因是因?yàn)閃arburg 公式吸光值換算成濃度,，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變,，濃度就會(huì)被放大,，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測(cè)試較純凈,、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō),，速度快,，操作簡(jiǎn)單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾,；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高,?！　”壬ǖ鞍踪|(zhì)定量　　蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸,，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。　　比色方法　　一般有BCA,，Bradford,，Lowry 等幾種方法?！　owry 法：以zui早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ),，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2 反應(yīng),，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物,。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高,。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑,；反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng)；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA,，Triton x-100,，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法?！　CA（Bicinchoninine　acid　assay）法：這是一種較新的,、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應(yīng)產(chǎn)生Cu ,，后者與BCA形成螯合物,，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長(zhǎng),。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*,，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對(duì)于Lowry法,，操作簡(jiǎn)單,，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾,?！　radford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm,。其zui大的特點(diǎn)是,，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測(cè)試方法的2 倍,；操作更簡(jiǎn)單,，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑,；化合物可以穩(wěn)定1小時(shí),，方便結(jié)果；而且與一系列干擾Lowry,，BCA 反應(yīng)的還原劑（如DTT,，巰基乙醇）相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的,。zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,，無(wú)可比性?！　∧承┏醮谓佑|比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致，感到迷惑,，究竟該相信哪種方法,？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性,。例如：Keller等測(cè)試人奶中的蛋白,，結(jié)果Lowry,，BCA 測(cè)出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著,。即使是測(cè)定同一樣品,，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測(cè)試后的濃度也不一致,。如用Lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml,，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度2.64mg/ml。因此,，在選擇比色法之前,，是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類(lèi)似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,。另外,，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題是樣品的吸光值太低,，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大,。關(guān)鍵問(wèn)題是，反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期,，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間,，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試,。時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低,。除此,，反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因,。此外,，非常重要的是，是用塑料的比色法,。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯,，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確,?！　〖?xì)菌細(xì)胞密度（OD 600）　　實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn),，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度,。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液,。為了保證正確操作，必須針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),，做出校正曲線,。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后,，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng),。另外,，需要注意的是，測(cè)試的樣品不能離心,，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài),。　　分光光度計(jì)的重要配件—— 比色杯　　比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯,、玻璃杯以及塑料杯,。根據(jù)不同的測(cè)量體積，有比色杯和毛細(xì)比色杯等,。一般測(cè)試核酸和紫外定量蛋白,，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測(cè)定,。因?yàn)榉磻?yīng)中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色,，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測(cè)試樣品,?！　∮捎诹硗鉁y(cè)試的樣品量不同，所以一般分光光度計(jì)廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求,。目前市場(chǎng)已經(jīng)存在一種既可用于核酸,、紫外蛋白質(zhì)定量，亦可用于蛋白比色法測(cè)定的塑料杯,，樣品用量?jī)H需50μl,，比色杯單個(gè)無(wú)菌包裝，可以回收樣品,。如Eppendorf UVette®塑料比色杯,，是目前比色杯市場(chǎng)上一個(gè)革新,。隨著生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科發(fā)展,，對(duì)此類(lèi)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究提出更高的要求,，分光光度計(jì)將是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室*的儀器，也成為微生物,、食品,、制藥等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的*設(shè)備之一?！　‰S著科技的發(fā)展,，現(xiàn)在比色杯已經(jīng)不是使用分光光度計(jì)時(shí)的*物品。目前國(guó)外Nanodrop公司（現(xiàn)已被Thermo Fisher公司收購(gòu)）生產(chǎn)的ND1000分光光度計(jì)與舊式分光光度計(jì)相比,，已經(jīng)可以做到無(wú)需稀釋樣品,，無(wú)需使用比色杯，每次測(cè)量?jī)H需1-2μl樣品即可完成測(cè)量,。 分光光度計(jì)注意事項(xiàng)　　1．該儀器應(yīng)放在干燥的房間內(nèi),，使用時(shí)放置在堅(jiān)固平穩(wěn)的工作臺(tái)上，室內(nèi)照明不宜太強(qiáng),。熱天時(shí)不能用電扇直接向儀器吹風(fēng),，防止燈泡燈絲發(fā)亮不穩(wěn)定?！　?．使用本儀器前,，使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和工作原理，以及各個(gè)操縱旋鈕之功能,。在未按通電源之前,，應(yīng)該對(duì)儀器的安全性能進(jìn)行檢查，電源接線應(yīng)牢固,，通電也要良好,，各個(gè)調(diào)節(jié)旋鈕的起始位置應(yīng)該正確，然后再按通電源開(kāi)關(guān),?！　?．在儀器尚未接通電源時(shí)，電表指針必須于“0”刻線上,，若不是這種情況,，則可以用電表上的校正螺絲進(jìn)行調(diào)節(jié)。 分光光度計(jì)使用方法　　1.接通電源,，打開(kāi)儀器開(kāi)關(guān),，掀開(kāi)樣品室暗箱蓋，預(yù)熱10分鐘,?！　?.將靈敏度開(kāi)關(guān)調(diào)至“1”檔（若零點(diǎn)調(diào)節(jié)器調(diào)不到“0”時(shí),，需選用較。）　　3.根據(jù)所需波長(zhǎng)轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)選擇鈕,?！　?.將空白液及測(cè)定液分別倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁,，放入樣品室內(nèi),，使空白管對(duì)準(zhǔn)光路?！　?.在暗箱蓋開(kāi)啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器,，使讀數(shù)盤(pán)指針指向t=0處?！　?.蓋上暗箱蓋,，調(diào)節(jié)“100”調(diào)節(jié)器，使空白管的t=100,，指針?lè)€(wěn)定后逐步拉出樣品滑竿,，分別讀出測(cè)定管的光密度值，并記錄,?！　?.比色完畢，關(guān)上電源,，取出比色皿洗凈,，樣品室用軟布或軟紙擦凈。