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分光光度計(jì)就是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器,。該儀器是食品廠、飲用水廠辦理QS,、HACCP認(rèn)證的*檢驗(yàn)設(shè)備,。 分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸,,蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量,。儀器分光光度計(jì)主要由光源、單色器,、樣品室、檢測(cè)器,、信號(hào)處理器和顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng)組成,。 分光光度計(jì)計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源,通過系列分光裝置,,從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源,,光源透過測(cè)試的樣品后,部分光源被吸收,,計(jì)算樣品的吸光值,,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比,。 核酸的定量 核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率zui高的功能,。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,,單鏈,、雙鏈DNA,以及RNA,。核酸的zui高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸,,事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如:1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,,37μg/ml的ssDNA,,40μg/ml的RNA,,30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,,從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測(cè)試前,選擇正確的程序,,輸入原液和稀釋液的體積,,爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而,,實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者zui頭痛的問題。靈敏度越高的儀器,,表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。 事實(shí)上,分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,,即分光光度計(jì)有一定的準(zhǔn)確度和度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A),。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),,都是正常的。另外,,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,,離子濃度等:在測(cè)試時(shí),離子濃度太高,,也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移,,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,,如TE,,可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,,尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了zui大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,,要求核酸吸光值至少大于0.1A,,吸光值在0.1-1.。在此范圍內(nèi),,顆粒的干擾相對(duì)較小,,結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低,,或者過高(超過光度計(jì)的測(cè)試范圍),。zui后是操作因素,,如混合要充分,否則吸光值太低,,甚至出現(xiàn)負(fù)值,;混合液不能存在氣泡,空白液無 |
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