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分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器。該儀器是食品廠,、飲用水廠辦理QS、HACCP認證的*檢驗設備。 分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規(guī)儀器,。常用于核酸,,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。儀器分光光度計主要由光源,、單色器,、樣品室、檢測器,、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成,。 分光光度計計采用一個可以產生多個波長的光源,通過系列分光裝置,,從而產生特定波長的光源,,光源透過測試的樣品后,部分光源被吸收,,計算樣品的吸光值,,從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比,。 核酸的定量 核酸的定量是分光光度計使用頻率zui高的功能,。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,,單鏈,、雙鏈DNA,以及RNA,。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260 nm,。每種核酸的分子構成不一,因此其換算系數不同,。定量不同類型的核酸,,事先要選擇對應的系數。如:1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,,37μg/ml的ssDNA,,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig,。測試后的吸光值經過上述系數的換算,,從而得出相應的樣品濃度。測試前,,選擇正確的程序,,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測試空白液和樣品液,。然而,,實驗并非一帆風順。讀數不穩(wěn)定可能是實驗者zui頭痛的問題,。靈敏度越高的儀器,,表現出的吸光值漂移越大,。 事實上,分光光度計的設計原理和工作原理,,允許吸光值在一定范圍內變化,,即分光光度計有一定的準確度和度。如Eppendorf Biophotometer的準確度≤1.0%(1A),。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動,,都是正常的。另外,,還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值,,離子濃度等:在測試時,離子濃度太高,,也會導致讀數漂移,,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,,如TE,,可大大穩(wěn)定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,,尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了zui大程度減少顆粒對測試結果的影響,,要求核酸吸光值至少大于0.1A,,吸光值在0.1-1.。在此范圍內,,顆粒的干擾相對較小,,結果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低,,或者過高(超過光度計的測試范圍),。zui后是操作因素,如混合要充分,,否則吸光值太低,,甚至出現負值;混合液不能存在氣泡,,空白液無 |
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