凱氏定氮儀是根據(jù)蛋白質(zhì)中氮的含量恒定的原理，通過(guò)測(cè)定樣品中氮的含量從而計(jì)算蛋白質(zhì)含量的儀器,。因其蛋白質(zhì)含量測(cè)量計(jì)算的方法叫做凱氏定氮法,，故被稱(chēng)為凱氏定氮儀，又名定氮儀,、蛋白質(zhì)測(cè)定儀,、粗蛋白測(cè)定儀。
使用步驟
消化
1,、準(zhǔn)備6個(gè)凱氏燒瓶,，標(biāo)號(hào),。1,、2、3號(hào)燒瓶中分別加入適當(dāng)濃度的蛋白溶液1.0mL,，樣品要加到燒瓶底,，切勿沾在瓶口及瓶頸上。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g,，濃硫酸2.0mL,，30%過(guò)氧化氫1.0mL。4,、5,、6號(hào)燒瓶作為對(duì)照，用以測(cè)定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì),，對(duì)樣品測(cè)定行校正,。4,、5、6號(hào)燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液,，其余所加試劑與1,、2、3號(hào)燒瓶相同,。2,、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上，接好抽氣裝置,。用微火加熱煮沸,，此時(shí)燒瓶?jī)?nèi)物質(zhì)炭化變黑，并產(chǎn)生大量泡沫,，務(wù)注意防止氣泡沖出管口,。待泡沫消失停止產(chǎn)生后，加大火力,，保持瓶?jī)?nèi)液體微沸,，至溶液澄清后，再繼續(xù)加熱使消化液微沸15min,。在消化過(guò)程中要隨時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶,，以使內(nèi)壁粘著物質(zhì)均能入底，以保證樣品消化,。消化時(shí)放出的氣體內(nèi)含SO2,，具有強(qiáng)烈刺激性，因此自始自終應(yīng)打開(kāi)抽水泵將氣體抽入自來(lái)水排出,。整個(gè)消化過(guò)程均應(yīng)在通風(fēng)櫥中行,。消化后，關(guān)閉火焰,，使燒瓶冷卻至室溫,。
蒸餾吸收
蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內(nèi)行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類(lèi)甚多,，大體上都由蒸氣發(fā)生,、氨的蒸餾和氨的吸收三分組成。
1,、儀器的洗滌
儀器安裝前,，各件需經(jīng)般方法洗滌干凈，所用橡皮管,、塞須浸在10%NaOH溶液中,，煮約10min，水洗,、水煮10min,，再水洗數(shù)次,，然后安裝并固定在只鐵架臺(tái)上。儀器使用前,，微量管道都須經(jīng)水蒸氣洗滌,，以除去管道內(nèi)可能殘留的氨，正在使用的儀器,，每次測(cè)樣前,，蒸氣洗滌5min即可。較長(zhǎng)時(shí)間未使用的儀器,，重復(fù)蒸氣洗滌,，不得少于三次，并檢查儀器是否正常,。仔細(xì)檢查各個(gè)連接處,，保證不漏氣。 在蒸氣發(fā)生器中加約2/3體積蒸餾水,，加入數(shù)滴硫酸使其保持酸性,，以避免水中的氨被蒸出而影響結(jié)果，并放入少許沸石(或毛細(xì)管等),，以防沸,。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經(jīng)插管入反應(yīng)室，但玻杯內(nèi)的水不要放光,，塞上棒狀玻塞,，保持水封，防止漏氣,。蒸氣發(fā)生后,，立即關(guān)閉廢液排放管上的開(kāi)關(guān)，使蒸氣只能入反應(yīng)室,，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)的水迅速沸騰,，蒸出蒸氣由反應(yīng)室上端口通過(guò)定氮入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置個(gè)錐形瓶接收冷凝水,。從定氮發(fā)燙開(kāi)始計(jì)時(shí),，連續(xù)蒸煮5min,，然后移開(kāi)煤氣燈,。沖洗畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管,，由于氣體冷卻壓力降低,，反應(yīng)室內(nèi)廢液自動(dòng)抽到反應(yīng)室外殼中，打開(kāi)廢液排出口夾子放出廢液,。如此清洗2~3次,，再在冷凝管下?lián)Q放個(gè)盛有硼酸-示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口浸沒(méi)在溶液中,，蒸餾1~2min，觀察錐形瓶?jī)?nèi)的溶液是否變色,。如不變色,，表示蒸餾裝置內(nèi)已洗干凈。移去錐形瓶,，再蒸餾1~2min,，用蒸餾水沖洗冷凝器下口，關(guān)閉煤氣燈,，儀器即可供測(cè)樣品使用,。
2、無(wú)機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品的蒸餾吸收
由于定氮操作繁瑣,，為了熟悉蒸餾和滴定的操作,，初學(xué)者宜用無(wú)機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品行反復(fù)練習(xí)，再行有機(jī)氮未知樣品的測(cè)定,。常用巳知濃度的標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨測(cè)試三次,。 取潔凈的100mL錐形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL,，次甲基藍(lán)-甲基紅混合示劑(呈紫紅色)3~4滴,，蓋好瓶口待用。取其中只錐形瓶承接在冷凝管下端,，并使冷凝管的出口浸沒(méi)在溶液中,。注意:在此操作之前打開(kāi)收集器活塞，以免錐形瓶?jī)?nèi)液體倒吸,。準(zhǔn)確吸取2mL硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液加到玻杯中,，小心提起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水沖洗小玻杯3次,，并放人蒸餾瓶中,。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30%NaOH溶液，使堿液慢慢入蒸餾瓶中,，在堿液尚未入時(shí),，將棒狀玻塞蓋緊。向小玻杯中加約5mL蒸餾水,，再慢慢打開(kāi)玻塞,，使半水入蒸餾瓶，半留在小玻杯中作水封,。關(guān)閉收集器活塞,，加熱蒸氣發(fā)生器，行蒸餾。錐形瓶中的硼酸-示劑混合液由于吸收了氨,，由紫紅色變成綠色,。自變色時(shí)起，再蒸餾3~5min,，移動(dòng)錐形瓶使瓶?jī)?nèi)液面離開(kāi)冷凝管下口約lcm,，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口，再繼續(xù)蒸餾1min,，移開(kāi)錐形瓶,，蓋好，準(zhǔn)備滴定,。 在次蒸餾畢后,，移去煤氣燈，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器間的橡膠管,，排除反應(yīng)畢的廢液,，用水沖洗小玻杯幾次，并將廢液排除,。如此反復(fù)沖洗干凈后,，即可行下個(gè)樣品的蒸餾。按以上方法用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨再做兩次,。另取2mL蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨行測(cè)定二次,。將各次蒸餾的錐形瓶起滴定。
3,、未知樣品及的蒸餾吸收
將消化好的蛋白樣品三支,，對(duì)照液三支，依次作蒸餾吸收,。 加5mL熱的蒸餾水至消化好的樣品或?qū)φ找褐?，通過(guò)小玻杯加到反應(yīng)室中，再用熱蒸餾水洗滌小玻杯3次,，每次用水量約3mL,，洗滌液并倒入反應(yīng)室內(nèi)。其余操作按標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的蒸餾行,。 由于消化液內(nèi)硫酸鉀濃度而呈粘稠狀,，不易從凱氏燒瓶?jī)?nèi)倒出，加入熱蒸餾水5 mL稀釋之,，如果有結(jié)晶析出,，微熱溶解，趁熱加入玻杯,，使其入反應(yīng)室,。此外,，還應(yīng)當(dāng)注意趁儀器洗滌尚未冷卻時(shí)立即加入樣品或?qū)φ找?，否則消化液通過(guò)冷卻的管道容易析出結(jié)晶,，成堵塞。
滴定
樣品和蒸餾畢后,，起行滴定,。打開(kāi)接受瓶蓋，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液行滴定,。待滴至瓶?jī)?nèi)溶液呈暗灰色時(shí),，用蒸餾水將錐形瓶?jī)?nèi)壁四周淋洗次。若振搖后復(fù)現(xiàn)綠色,，應(yīng)再小心滴入標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液半滴,，振搖觀察瓶?jī)?nèi)溶液顏色變化，暗灰色在二分鐘內(nèi)不變,，當(dāng)視為到達(dá)滴定終點(diǎn),。若呈粉紅色，表明已越滴定終點(diǎn),，可在已滴定耗用的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液用量中減去0.02mL,，每組樣品的定氮終點(diǎn)顏色致。對(duì)照液接受瓶?jī)?nèi)的溶液顏色不變或略有變化尚未出現(xiàn)綠色,，可以不滴定,。記錄每次滴定耗用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液毫升數(shù)，供計(jì)算用,。
