隨著生物制藥的迅猛發(fā)展,，凍干已經(jīng)成為一種有效的技術(shù)來解決制藥過程中存在的化學(xué),，物理，生物的不穩(wěn)定性問題,。結(jié)合凍干本身的技術(shù)特點,，凍干產(chǎn)品開發(fā)的最終目的是要保證產(chǎn)品質(zhì)量的同時利用最短的生產(chǎn)時間來節(jié)約成本。產(chǎn)品的質(zhì)量包括安全,，高效,，穩(wěn)定，較短的復(fù)水時間,，優(yōu)雅的蛋糕外觀等,。

凍干是一個復(fù)雜的傳熱傳質(zhì)的過程，如果處理不當(dāng),，在冷凍以及干燥過程中,，樣品中的活性成分以及賦形劑會發(fā)生一些物理或化學(xué)變化，從而破壞了各自原有的功能特性,，因此需要進行采取合理的方法來加以解決,，從而達到凍干制劑開發(fā)的最終目的。

預(yù)凍階段

樣品溶液隨著溫度的降低,，含有的水先凍結(jié)成冰晶析出,，剩余的溶液的濃度越來越大，形成最大濃縮凍結(jié)液,，溶質(zhì)和溶劑分離,，在這個階段，水分的結(jié)晶會導(dǎo)致蛋白濃度增加,，賦形劑濃度增加,，離子強度增加,，粘度增加,，賦形劑結(jié)晶或相分離，pH改變等,，這些可能會影響到蛋白的穩(wěn)定性,。

干燥

結(jié)晶的冰通過升華去除，未結(jié)晶的冰通過解吸附去除,，樣品中的水分含量是一個動態(tài)變化的過程,，樣品會面臨水分去除產(chǎn)生的應(yīng)力,，即干燥應(yīng)力，導(dǎo)致配方中成分發(fā)生一定的變化,。

儲存

較低的水分含量,，溫度的偏差，賦形劑的相分離,。

常用賦形劑的功能性及物理狀態(tài)

表1：常用賦形劑的功能性及期望的物理狀態(tài)

然而在凍干過程中,，活性成分以及賦形劑之間具有復(fù)雜的相互影響，不同的濃度,，不同的比例,，不同的種類等都會引起一些結(jié)構(gòu)狀態(tài)的變化，從而導(dǎo)致其原本的功能喪失,，比如：若海藻糖結(jié)晶會導(dǎo)致保護功能的喪失,；若甘露醇變?yōu)闊o定形結(jié)構(gòu)，會降低產(chǎn)品的關(guān)鍵溫度,，并且無定形態(tài)具有較差的穩(wěn)定性,，喪失了其作為填充劑的功能；若緩沖液成分結(jié)晶,，會導(dǎo)致pH值的變化,，緩沖功能喪失，蛋白穩(wěn)定性受到影響,。因此研究各個配方組分之間的相互影響作用對確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量具有較大的作用,。

01.糖類和填充劑功能性之間的相互影響

雙糖是常用的凍干保護劑，如蔗糖,，海藻糖,，雙糖與蛋白的最小質(zhì)量比通常為3:1到5:1，但是糖類通常會降低樣品的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度,，使得凍干通常會花費較長的時間,，因此會將糖類跟具有較高共晶融化溫度的填充劑結(jié)合使用，如甘露醇,，甘氨酸,，這樣可以讓樣品在較高的溫度下進行干燥，形成良好的外觀結(jié)構(gòu),，節(jié)約干燥時間(Tang and Pikal, Pharm Res. 2004; Johnson, Kirchhoff and Gaud, J Pharm Sci. 2001)。

市面上有一些藥品就是以這種方式開發(fā)的,，如阿必魯泰（Tanzeum）,，是一種融合蛋白,，糖尿病患者用藥，配方中含海藻糖以及甘露醇成分,；沙格司亭凍干粉注射劑（Leukine）是一種源于酵母的重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）,，能夠刺激各種免疫細(xì)胞的生長和活化，已用于白血病患者降低感染風(fēng)險,，配方中含蔗糖和甘露醇成分,；魯磨西替（Lumoxiti）是一種單抗抗癌制劑，配方中含蔗糖和甘氨酸成分,。

圖1：阿必魯泰（Tanzeum）

這種結(jié)合的有效性取決于：在凍干和儲存過程中兩種賦形劑的物理形態(tài),；正確的比例以及凍干條件。理想狀態(tài)下,，整個過程中糖類應(yīng)當(dāng)處于無定形狀態(tài),，起到穩(wěn)定劑的作用；填充劑在干燥之前應(yīng)當(dāng)充分結(jié)晶,，使得樣品具有良好的結(jié)構(gòu)強度,，提高關(guān)鍵產(chǎn)品溫度，縮短凍干時間,。

Part.1 蔗糖對甘氨酸填充劑結(jié)晶的抑制影響

實驗通過將蔗糖和甘氨酸以不同比例（從1:9到9:1）溶解于水中,，分別在15℃退火1h 和不進行退火，凍干后樣品通過近紅外光譜測定甘氨酸的結(jié)晶度,。觀察到當(dāng)蔗糖：甘氨酸＞4時,，甘氨酸失去了其填充劑的功能（Bai et al., J Pharm. Sci. 2004）。

圖2：蔗糖對甘氨酸填充劑功能的影響

Figure plotted from data given in Bai et al., J PHarm. Sci. 2004

Part.2 海藻糖+甘露醇功能性的相互影響

不同比例的海藻糖+甘露醇溶液進行凍干,，二者的比例決定了各自的物理形態(tài)以及其發(fā)揮的功能性（Jena, Suryanarayanan and Aksan, Pharm Res. 2016）,。

表2：海藻糖和甘露醇比例對其物理形態(tài)及功能性影響

海藻糖在酸性條件下不會水解，具有較高的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度,，但是具有結(jié)晶傾向性,。當(dāng)凍干的條件利于海藻糖無定形形態(tài)存在時，會抑制甘露醇的結(jié)晶,，相反,，當(dāng)凍干的條件利于甘露醇結(jié)晶形態(tài)存在時，會促進海藻糖二水合物的產(chǎn)生,，失去其無定形結(jié)構(gòu),，二者相互抑制，因此需要確定最佳的一個比例條件,，確保各自能發(fā)揮本身應(yīng)起的作用,。從實驗結(jié)果來看，當(dāng)海藻糖和甘露醇比例為1:3時,，甘露醇保持其原有的晶體形態(tài),，海藻糖保持其原有的無定形態(tài),，在配方中分別起填充劑和穩(wěn)定劑的功能（Sundaramurthi and Suryanarayanan, J. Phys. Chem. Letters 2010; Sundaramurthiet. al., Pharm. Res. 2010; Sundaramurthi and Suryanarayanan, Pharm. Res. 2010;）。

Part.3 海藻糖、API（BSA）和甘露醇的相互影響

海藻糖—BSA---甘露醇凍干混合液，海藻糖和BSA的不同比例對海藻糖物理形態(tài)的影響,，甘露醇濃度固定在10%W/W，總的固形物含量22%W/W（Jena et al., Int J. Pharm.2019）。

表3：BSA和海藻糖比例對海藻糖物理形態(tài)影響

實驗結(jié)果表明

當(dāng)BSA與海藻糖比例為10:1時,，海藻糖能起到良好的穩(wěn)定劑作用,。

Part.4 蔗糖和甘露醇的相互影響

除了抑制作用外,，糖可能會改變甘露醇的存在形式，甘露醇有幾種形態(tài)存在,，無水甘露醇（α-，β-,，δ-）和半水合物-MHH,。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)蔗糖：甘露醇為1:4時,，蔗糖會保留無定形態(tài),，甘露醇為結(jié)晶態(tài)（部分以MHH形式存在）,，MHH甘露醇在最終的干燥產(chǎn)品中是不希望存在的,，在儲存的過程中，MHH會脫水,，釋放水分,，水分可能會跟產(chǎn)品中的其他組分進行反應(yīng),，無定形狀態(tài)的蔗糖吸收水分后會發(fā)生結(jié)晶，從而失去了對活性成分的保護功能（Thakral, Sonjeand Suryanarayanan, Int J. Pharm. 2020）,。

因此,，綜上所述，開發(fā)穩(wěn)定的凍干產(chǎn)品配方,，并達到期望的產(chǎn)品質(zhì)量屬性,，需要正確地選擇賦形劑的濃度,，包括糖與填充劑的比例,，蛋白與糖的比例,，并且需要對凍干條件進行優(yōu)化,。

02.API/賦形劑對緩沖液功能性的影響

緩沖液需要加入到溶液中進行pH的控制,。常見的緩沖液包括磷酸鈉緩沖液,，磷酸鉀緩沖液,，組氨酸緩沖液，tris 緩沖液,，檸檬酸鹽緩沖液,，琥珀酸鹽緩沖液等。凍干產(chǎn)品緩沖液的選擇需要考慮蛋白的pKa以及緩沖液組分的結(jié)晶傾向,，如磷酸鈉緩沖液中,，酸性的磷酸二氫一鈉是無定形態(tài)；堿性的磷酸氫二鈉在凍結(jié)過程中會結(jié)晶成Na?HPO?·12H?O,，導(dǎo)致凍結(jié)濃縮液的pH降低,，失去了緩沖液的功能，因此緩沖液成分的結(jié)晶往往是不期望的,。

Part.1 緩沖液,，蛋白，糖之間的相互影響

有實驗研究了10mM 磷酸鈉緩沖液,，100mM 磷酸鈉緩沖液,，含5% w/w的纖維二糖，纖維二糖,，在低pH下不會水解,，不會結(jié)晶（通過在凍結(jié)過程中測定其pH值以及使用原位X射線衍射儀對結(jié)晶組分進行鑒定）以及100mM 磷酸鉀緩沖液三種緩沖液與纖維二糖，蛋白之間的相互影響,，如下表所示（Thorat, Munjal, Geders and Suryanarayanan, J. Control Rel.2020）——

表4：緩沖液,、糖及蛋白成分對pH變化的影響

樣品中活性成分蛋白、糖與緩沖液之間具有協(xié)同作用,，蛋白可以抑制緩沖液結(jié)晶,，使其保持無定形狀態(tài)，緩沖液反過來可以維持特定的pH值,，增加蛋白的穩(wěn)定性,；一定濃度的糖可以抑制緩沖液的結(jié)晶，保持其無定形態(tài),，從而維持特定的pH值,，提高蛋白穩(wěn)定性。

Part.2 甘氨酸對磷酸鈉緩沖液結(jié)晶以及pH變化的影響

表5：甘氨酸對磷酸鈉緩沖液結(jié)晶以及pH變化的影響

在10 mM緩沖液中,，甘氨酸濃度越高,，pH值變化越明顯，另外通過用同步X射線衍射法監(jiān)測溶質(zhì)結(jié)晶程度,，磷酸鹽緩沖液對甘氨酸結(jié)晶具有濃度依賴性抑制作用,，20%W/V甘氨酸和50-200mM緩沖液,，緩沖液濃度越高，抑制作用越強,，并且在-20℃進行退火處理,，能夠增強甘氨酸的結(jié)晶度。pH的改變能夠引起蛋白凝聚,，可以通過降低緩沖液濃度,，使用不結(jié)晶的緩沖液，通過蛋白,，糖來抑制緩沖液結(jié)晶,，并且某些蛋白本身就具有pH緩沖的功能（Pikal-Cleland et al., J. Pharm. Sci. 2002；Varshney et al., Pharm. Res. 2007,；Thorat, Munjal, Geders and Suryanarayanan, J. Control Rel. 2020; Sundarmurathi and Suryanarayanan, J. Phys. Chem. B. 2011; Gokarnet al., J. Pharm. Sci. 2008）,。

03.總結(jié)

凍干配方成分之間具有復(fù)雜的相互作用，某些組分可以通過改變其他組分的相行為來影響其功能性,，必須正確選擇配方中賦形劑的濃度,，使得每種成分能夠維持其最佳的物理形態(tài)，發(fā)揮應(yīng)有的功能性,。

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