一,、實驗要求：
1,、掌握從土壤中提取微生物的實驗原理。
2,、掌握倒平板的技術和分離純化大腸桿菌的基本操作技術,。
3、能通過后續(xù)實驗對目的菌做出簡單生化鑒定,。
二,、實驗目的：從土壤中分離提取大腸桿菌。
三、實驗背景：
1,、大腸桿菌生物學分類：細菌域,，變形菌門，γ-變形菌綱,，腸桿菌目,，腸桿菌科，埃希氏菌屬,，大腸桿菌種
2,、大腸桿菌形態(tài)特征：革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5×1～3微米,。周身鞭毛,，能運動，無芽孢,。能發(fā)酵多種糖類產酸,、產氣，兼性厭氧菌,。該菌在自然界的水中可存活數周至數月,，在溫度較低的糞便中存活更久。膽鹽,、煌綠等對大腸桿菌有抑制作用,。對磺胺類、鏈霉素,、氯霉素等敏感,，但易耐藥，是由帶有R因子的質粒轉移而獲得的,。
四,、器材與試劑：
①土鏟、盛9m1無菌水的試管,、三角燒瓶,、盛100m1無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃涂棒,、無菌吸管,、接種環(huán)、酒精燈,、火柴,、無菌培養(yǎng)皿、顯微鏡,、載玻片、蓋玻片、量筒,、吸水紙,、燒杯、電爐,、石棉網,、鑷子、恒溫培養(yǎng)箱,、生化培養(yǎng)箱 高溫滅菌鍋,、電子天平、天平,、pH試紙,、擦鏡紙、棉花,、紗布,、報紙、試管架,、試管夾,、標簽、記號筆,、放大鏡,、載物盤等。②蒸餾水,、牛肉膏,、蛋白胨、氯化鈉,、瓊脂 ,、K2HPO4、NaCl,、乳糖,、2%伊紅Y溶液、0.35%美藍溶液,、檸檬酸鐵銨,、Na2S2O3·5H2O（硫代硫酸鈉）、3%～10%過氧化氫,、香柏油,、草酸銨結晶紫染液、革蘭氏碘液,、95%乙醇,、番紅染液
五,、實驗內容：
1、制作牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,、伊紅美藍培養(yǎng)基,。
2、對培養(yǎng)基,、滴管,、試管、玻璃棒等器材進行高溫滅菌處理,。
3,、用稀釋法從土壤中分離細菌。
4,、將樣品接種到伊紅美藍平板上進行分離,。
5、觀察外部特征,、鏡檢,，將疑似大腸桿菌菌種接種到牛肉膏蛋白胨斜面上，進行擴大培養(yǎng),。
6,、對菌種進行生化反應并簡單鑒定。
六,、實驗步驟：
1,、培養(yǎng)基的配制
①牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基
配方：牛肉膏（1克）；蛋白胨（2克）,；氯化鈉（1克 ）,；瓊脂 （4克 ）；水（200毫升）
方法：在燒杯內加水100毫升,，放入牛肉膏,、蛋白胨和氯化鈉，用蠟筆在燒杯外作上記號后,，放在火上加熱,。待燒杯內各組分溶解后，加入瓊脂,，不斷攪拌以免粘底,。等瓊脂*溶解后補足失水，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調整pH值到7.2～7.6,分裝在各個試管里,，加棉花塞,，制斜面。
②伊紅美藍培養(yǎng)基
配方：乳糖 （2克）,，蛋白胨 （2克）,，NaCl （1克）,，K2HPO4 （1克），2%伊紅水溶液 （4毫升）,，0.35%美藍水溶液 （4毫升）,，瓊脂 （4克），水 （200毫升）,，pH 7.1 注：先調PH，滅菌在加乳糖,、伊紅,、美藍
方法：先配200毫升蛋白胨水瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化，冷卻至60℃左右時,，再把已滅菌的乳糖溶液,、伊紅水溶液及美藍水溶液按上述量以無菌操作加入。搖勻后,，立即倒平板（見第三步）,。乳糖在高溫滅菌易被破壞必須嚴格控制滅菌溫度，一般是0．70kg/cm2?。?0磅/英寸2?。?15．2℃滅菌20分鐘,。
③檸檬酸鐵銨半固體培養(yǎng)基,。（用于生化反應中H2S試驗）
配方：蛋白胨 （2克），NaCl （1克）,，檸檬酸鐵銨 （0.1克）,，硫代硫酸鈉 （0.1克），瓊脂 （1.2克）,，蒸餾水 （200毫升）,，PH 7.6
2、將所需器材高溫滅菌,，備用,。
3、倒平板 ：需要倒三皿,，防止失敗可多做幾皿,。其方法是右手持盛伊紅美藍培養(yǎng)基的試管或三角燒瓶，置火焰旁邊,，左手拿平皿并松動試管塞或瓶塞,，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出,，如果試管內或三角燒瓶內的培養(yǎng)基一次可用完,，則管塞或瓶塞不必夾在手指中,。試管（瓶）口在火焰上滅菌，然后左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫,，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml,，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布,，平置于桌面上,，待凝后即成平板。也可將平皿放在火焰附近的桌面上,，用左手的食指和中指夾住管塞并打開培養(yǎng)皿,，再注入培養(yǎng)基，搖勻后制成平板,。分別標號10-4,、10-5、10-6,。
4,、土壤稀釋液的制備：在沈陽大學4號樓門前樹林內選取土樣，稱取土壤1g,，放入99mL無菌水的三角瓶中,，振蕩10min，即為稀釋10－2的土壤懸液,。另取裝有9mL無菌水試管4支,，用記號筆編上10－3、10－4,、10－5,、10－6。取已稀釋成10－2的土壤液,，振蕩后靜止0.5min,，用無菌吸管吸取1mL土壤懸液加入10－3的無菌水的試管中，并在試管內輕輕吹吸數次,，使之充分混勻,，即成10－3土壤稀釋液。同法依次連續(xù)稀釋至10－4 ,，10－5,，10－6土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中,，應用一支吸管由濃到稀,，稀釋到底。
5,、涂布接種：稀釋完畢后,，可用原來的移液管,，從菌液濃度zui小的10-6的稀釋液開始吸取1ml 10-6稀釋液，加到相應編號10-6的無菌培養(yǎng)皿內,，以相同方法分別吸取1ml10-5,、10-4的稀釋液加到相應編號為10-5、10-4的無菌培養(yǎng)皿內,。用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻,。37℃恒溫箱培養(yǎng)48小時。
6,、觀察初檢：三種菌種濃度的培養(yǎng)皿中均會出現大腸桿菌菌落,，尋找菌落中心呈暗藍黑色，發(fā)金屬光澤的菌種,。并進行鏡檢, 觀察。
7,、擴大培養(yǎng)：將疑似菌落接種于斜面培養(yǎng)基上,，進行擴大培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)48小時,。
8,、生化鑒定：
①革蘭氏染色：經革蘭氏染色可見革蘭氏陰性的短桿菌, 兩端鈍圓。散在或成對存在,；
②硫化氫試驗：用檸檬酸鐵銨半固體培養(yǎng)基接種待檢菌種,；
③過氧化氫試驗。
9,、觀察實驗結果,，并記錄，整理器材,。
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