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(1)氯仿提取法:測定方法如下:
(2)稀釋加熱法:即水稀釋加熱法作為簡便的前處理方法被普遍采用,由于稀釋倍數(shù),,加熱溫度和時間不同,,結(jié)果也不全相同,其中主要方法見表6,。
在這些方法中由于不確定因素太多,,因此值得探索的地方很多。為了克服稀釋加熱法的缺陷,,避免濁度生成,,人們開發(fā)出了使用表面活性劑(0.04% TritonX -100)稀釋,80℃5分鐘加熱處理方法,。這個前處理方法,,能得到很好的血漿內(nèi)毒素回收率。減少非特異性濁度所引起的假陽性反應(yīng),。尤其是日本和光純藥的Toxinonuter ET201采用比濁時間分析法檢測,,能得到很好的實驗結(jié)果。
(3)高氯酸法(PCA)與新高氯酸法(New PCA):所謂高氯酸法(PCA),,即血漿加高氯酸后,產(chǎn)生的變性沉淀物用離心法除去,,用上清液進行比色測定,。后來人們又發(fā)現(xiàn)這些沉淀物中含有內(nèi)毒素活性物質(zhì),因而對變性的血漿蛋白不進行沉淀,,而進行現(xiàn)溶解處理,,這就是新高氯酸法(New PCA),一般新高氯酸法的測定結(jié)果要比高氯酸法高8~10倍,。
一般高氯酸法只測定血中游離的內(nèi)毒素,,而新高氯酸法可以將游離內(nèi)毒素和蛋白結(jié)合內(nèi)毒素一起測定出來。也就是說,,新高氯酸的測定值減去高氯酸法的測定值,,就等于結(jié)合型內(nèi)毒素的量;我們可以同時使用兩種方法檢測以查明內(nèi)毒素與蛋白的結(jié)合情況,,并且可以對病人的病情發(fā)展進行分析,。具體測定方法如下所示:
另外,在我們對血漿中的內(nèi)毒素和鱟試驗法檢測時,,前處理加熱對血漿中和水中內(nèi)毒素影響要有一個認識,。細菌內(nèi)毒素在人體內(nèi)的分布往往以兩種方式存在,一種為游離型,,另外一種為蛋白結(jié)合型,。我們知道,,細菌內(nèi)毒素在水中存在時對加熱是十分敏感的,而在血中的情況又是怎樣的,?人們通過實驗發(fā)現(xiàn):血漿中的內(nèi)毒素在經(jīng)過100℃加熱1分鐘或10分鐘,,其標準曲線沒有出現(xiàn)明顯的差別。而水中的內(nèi)毒素經(jīng)1分鐘加熱后,,其標準曲線趨向平坦,,10分鐘加熱后,接近水平,。這可能是脂多糖分子在水中加熱后出現(xiàn)集結(jié)的原故,。而在血漿的內(nèi)毒素則不同,團塊的形成會受到血小板的抑制,,內(nèi)毒素可與多種血液成分結(jié)合,,如血小板﹑抗體、粘性蛋白等,,這些物質(zhì)可能保護血漿內(nèi)毒素與LAL發(fā)生反應(yīng),。因此這就是加熱血漿也不會破壞其內(nèi)毒素的原因。
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