摘要：本文旨在介紹一種基于ICH Q14指南的有關(guān)物質(zhì)分析方法開發(fā)流程,，該方法利用ACD/AutoChrom 軟件和統(tǒng)計(jì)學(xué)工具來開發(fā)HPLC分析方法和驗(yàn)證分析方法的耐用性范圍。通過案例研究某主成分及其雜質(zhì)的分析,，展示了如何確保方法的專屬性,、準(zhǔn)確度和靈敏度及確定合理的耐用性范圍。
引言
在藥物開發(fā)過程中，有關(guān)物質(zhì)的分析是確保藥品質(zhì)量的關(guān)鍵步驟,。ICH Q14指南提供了一個(gè)關(guān)于方法開發(fā)的框架,，要求分析方法必須滿足專屬性、準(zhǔn)確度和靈敏度等要求,。本文通過某主成分的案例,，詳細(xì)描述了按照ICH Q14要求如何利用ACD / AutoChrom 軟件和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來開發(fā)和驗(yàn)證HPLC分析方法。
方法開發(fā)范圍及目的
目的：某主成分是一種原料藥,，本研究旨在開發(fā)一種分析方法,，用于檢測該主成分中的已知和未知雜質(zhì)，確保產(chǎn)品質(zhì)量,。
開發(fā)范圍：包括Imp. 1,、Imp. 2、Imp. 3,、Imp. 4,、Imp. 5、Imp. 6等已知雜質(zhì)以及未知雜質(zhì)和總雜質(zhì),。
分析目標(biāo)概況
方法開發(fā)過程
知識(shí)準(zhǔn)備和風(fēng)險(xiǎn)分析：
基于對化學(xué)結(jié)構(gòu),、色譜知識(shí)及ACD/Labs軟件對該產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分析方法開發(fā)，確保各組分的專屬性,、靈敏度及準(zhǔn)確性,。
PH的確定：利用ACD/Labs軟件預(yù)測該主成分及各雜質(zhì)的log D
各組份在pH 0-11范圍內(nèi)log D均大于1，無保留的風(fēng)險(xiǎn),，且不受pH影響,，考慮到大多數(shù)色譜柱的pH耐用性，pH確定為2.0~8.0范圍,。
檢測波長的確定：使用DAD,，獲得各組份的DAD數(shù)據(jù)，如下圖,。
通過DAD圖進(jìn)行對比,，選擇230nm波長作為該分析方法的檢測波長。
分析方法篩選部分：
色譜柱的選擇：由于各組份主要結(jié)構(gòu)差異為苯環(huán)上取代基,，本次篩選了Inertsil ODS-3,，Welch Xtimate C18, Phenomenex Kinetex-BiPhenyl，最終確定了Phenomenex Kinetex-BiPhenyl 作為本方法中的色譜柱,。
流動(dòng)相的選擇：弱洗脫,，本方法中pH的選擇范圍在2.0-8.0，經(jīng)過篩選,，選擇0.1%磷酸溶液為弱洗脫,。強(qiáng)洗脫,，部分雜質(zhì)的Log D約為5，經(jīng)過篩選選擇及乙腈作為流動(dòng)相,，梯度洗脫,。
篩選獲得的方法中發(fā)現(xiàn)有一個(gè)未知工藝雜質(zhì)與不同已知雜質(zhì)有較多的分離問題，是本方法的主要的專屬性方面的風(fēng)險(xiǎn),。
色譜方法優(yōu)化和初步鑒定：
1,、使用一臺(tái)儀器（A品牌），設(shè)計(jì)兩個(gè)梯度,，三個(gè)柱溫（25℃,、30℃、35℃）的兩因素梯度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
洗脫梯度 1：
洗脫梯度 2：
根據(jù)以上條件得到的圖譜,，使用 AutoChrom 軟件進(jìn)行建模,，模型如下：
從模型分析，隨著柱溫的升高以及更緩（增加一個(gè)梯度拐點(diǎn)）的洗脫梯度,，未知雜質(zhì)出峰位置會(huì)相對主峰,、Imp.2和 Imp.3發(fā)生較大后移。在柱溫40℃及以下洗脫梯度（表一）時(shí),，未知雜質(zhì)出峰在Imp.3后,，分離較好（軟件中顯示分離度：4.4），且柱溫耐用性范圍較寬（可達(dá)±5℃）,，故以柱溫40℃和表一梯度作為初步確認(rèn)的中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件,，在相同品牌不同設(shè)備編號(hào)的儀器上進(jìn)行方法確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。
表一：梯度表（柱溫40℃）
2,、使用中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件在相同品牌不同設(shè)備編號(hào)的儀器上進(jìn)行重現(xiàn),，圖譜如下：
不同設(shè)備編號(hào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表：
解析：儀器2與儀器3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Imp.3與未知雜質(zhì)實(shí)際分離度和軟件模擬結(jié)果重現(xiàn)度高,，而儀器1相對另外兩臺(tái)儀器,，主峰保留時(shí)間提前了近兩分鐘，同時(shí)Imp.3與未知雜質(zhì)分離最差,。其原因可能與泵和管路的差異有關(guān),。
3、為了確保后續(xù)方法在不同儀器能有較好的重現(xiàn)性,，在分離最差的儀器（儀器1）上重新進(jìn)行梯度溫度雙因素建模,，設(shè)計(jì)洗脫梯度和三個(gè)柱溫（25℃、35℃,、45℃）進(jìn)行兩因素實(shí)驗(yàn)以建立數(shù)據(jù)模型， 洗脫梯度如下表：
洗脫梯度 1：
洗脫梯度 2：
根據(jù)以上條件得到的圖譜進(jìn)行建模,，模型如下：
基于儀器1上的建立的新模型,，并比較在原方法開發(fā)的儀器上建立的模型,，重新調(diào)整中心點(diǎn)的位置到柱溫35℃及以下洗脫梯度（表二）。此時(shí)未知雜質(zhì)與Imp.3分離較好（軟件預(yù)測分離度：5.2）,，且柱溫耐用性范圍較寬（可達(dá)±5℃）,，故以柱溫35℃和表二梯度作為中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件，在儀器1上進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。
表二：梯度表（柱溫35℃）
4,、使用中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)條件在相同品牌不同設(shè)備編號(hào)的儀器上進(jìn)行重現(xiàn)
儀器1上中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)加雜溶液（主成分：1mg/ml，各雜質(zhì)：1μg/ml）圖譜如下：
解析：經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),，Imp.3 與未知雜質(zhì)實(shí)際分離度為：5.7,，和軟件模擬重現(xiàn)度好，結(jié)合原模型獲得的空間,，調(diào)整中心點(diǎn),，確定使用該梯度條件及柱溫為 35℃。
方法耐用性范圍的確定：
利用AutoChrom 軟件進(jìn)行耐用性預(yù)測,，并使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（JMP）對方法參數(shù)的范圍和相互作用進(jìn)行探索,，建立耐用性空間。
下表展示了選取的變化因素及高低水平的設(shè)置,，在AutoChrom 軟件中預(yù)測出如下條件變化產(chǎn)生243個(gè)實(shí)驗(yàn)組合的最小分離度,。
利用JMP對方法參數(shù)的范圍和相互作用進(jìn)行探索，將AutoChrom 軟件中模擬出243個(gè)實(shí)驗(yàn)的最小分離度導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（JMP）,，進(jìn)行處理得到如下結(jié)果：
解析：由預(yù)測值-實(shí)際值圖可以得出,，本數(shù)據(jù)模型RSq值為0.95，模型準(zhǔn)確度較高,，故AutoChrom 軟件模擬預(yù)測出的243個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有參考意義,，上表設(shè)定的條件范圍為耐用性空間范圍；由預(yù)測刻畫器圖可以看出,，有機(jī)相起始比例,、有機(jī)相終止比例、柱溫和流速對于分離度有影響,，其中柱溫的影響是顯著的,，由模型數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果可以初步確定本方法在柱溫35℃，流速為1.2ml/min,，洗脫梯度為如下表格,。
在此數(shù)據(jù)模型下，探索統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（JMP）對于方法開發(fā)階段的幫助,，在預(yù)測刻畫器中,，使用設(shè)計(jì)空間刻畫器，設(shè)置我們所需要達(dá)到的低分離度,，可以得到我們滿足分離要求的空間,，由于本方法模型數(shù)據(jù)均符合分離要求,，在此設(shè)計(jì)一個(gè)較大的分離度要求（分離度≥2.5）
解析：在設(shè)計(jì)空間刻畫器中可以看到，模型數(shù)據(jù)中滿足分離度要求（分離度≥2.5）的條件占比在97.56%,，如需找到一空間使所有分離度均≥2.5,，可繼續(xù)內(nèi)移。
解析：在內(nèi)移至所有條件均滿足分離度要求（分離度≥2.5）時(shí),，此時(shí)的方法為耐用性范圍為：有機(jī)相起始比例（28±1%）,、有機(jī)相終止比例（32±1%）、梯度洗脫時(shí)間（25±1min）,、柱溫（30~37℃）及流速（1.2±0.1ml/min）,；在此基礎(chǔ)上將限值發(fā)送到模擬器對耐用性范圍進(jìn)行驗(yàn)證。
解析：由模擬器模擬后得到,，耐用性范圍與設(shè)計(jì)空間刻畫器一致,。
從實(shí)際出發(fā)，以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)來論證本方法耐用性空間,，在對分離影響較大的各個(gè)因素中取邊界點(diǎn),，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)出12針處于耐用性空間邊界的12個(gè)色譜條件,，如下表格：
并且在儀器1進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：
解析：在耐用性空間邊界點(diǎn)的12個(gè)色譜條件下，Imp.3與未知雜質(zhì)分離均較好,，主峰及其他已知雜質(zhì)與相鄰峰分離也較好,。
為了進(jìn)一步確保此方法在不同品牌儀器間差異，再從統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件設(shè)計(jì)的12個(gè)色譜條件中選擇序號(hào)1,、2,、3、7,、9和10色譜條件（每個(gè)因素的高低水平都各有三個(gè)實(shí)驗(yàn)條件,，相當(dāng)于也是均勻分布在耐用空間上的6個(gè)點(diǎn)），在不同品牌儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，圖譜如下：
解析：在不同品牌儀器中,，6個(gè)色譜條件下，主峰和已知雜質(zhì)與相鄰峰分離均較好,，本方法耐用性空間建立成功,。
耐用性范圍為：有機(jī)相起始比例（28±1%）、有機(jī)相終止比例（32±1%）,、梯度洗脫時(shí)間（25±1min）,、柱溫（35±5℃）及流速（1.2±0.1ml/min）。
結(jié)論
本研究成功開發(fā)了一種基于ICH Q14的HPLC分析方法,，用于某主成分及其雜質(zhì)的檢測,。利用ACD/ AutoChrom 軟件和統(tǒng)計(jì)學(xué)工具,，優(yōu)化了色譜條件，確保了方法的專屬性,、準(zhǔn)確度和靈敏度，并建立了方法的耐用性空間,。
Kinetex Biphenyl
• 出色的分離能力
• 耐用且可靠
• 100 % 水溶液穩(wěn)定
具備 C18 無法提供的選擇性,！
不僅僅只是高性能和強(qiáng)保留，Kinetex Biphenyl 還擁有傳統(tǒng) C18 色譜柱無法媲美的能力,?？商峁┚哂泄潭ㄏ嗟暮?殼顆粒所帶來的高性能，這種固定相能夠?yàn)榉聪喾椒ㄩ_發(fā)中改善選擇性的優(yōu)選,。使用 Kinetex Biphenyl 色譜柱可增強(qiáng)保留能力,，獲取更高的靈敏度和整體結(jié)果；尤為適合芳香族化合物的分析,。
芳香族 π-π 相互作用
在聯(lián)苯基的芳環(huán)和目標(biāo)分子的芳環(huán)以及 π 電子之間
疏水性相互作用
發(fā)生在 Biphenyl 配體的碳骨架與目標(biāo)分析物之間
弱離子或偶極-偶極相互作用
雙環(huán)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的高電子密度能夠發(fā)揮類似于弱陽離子交換劑的作用,，從而增強(qiáng)堿性分析物的保留能力。
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