瓜蔞子探針法PCR鑒定試劑盒（不含內(nèi)參）

Semen trichosanthis(Trichosanthes kirilowii栝樓)Probe qPCR Kit(without internal control)

瓜蔞子探針法PCR鑒定試劑盒（不含內(nèi)參）產(chǎn)品及特點(diǎn)：
該試劑盒基于熒光定量 PCR 技術(shù),，利用 TaqMan 探針的特異性識(shí)別能力。針對(duì)瓜蔞子基因組 DNA 中的特定片段設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針,。在 PCR 反應(yīng)中,，若樣本中存在瓜蔞子的 DNA，引物會(huì)特異性結(jié)合到相應(yīng)的目標(biāo)區(qū)域,，在 Taq 酶作用下進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增,。同時(shí)，熒光探針與擴(kuò)增產(chǎn)物中的目標(biāo)序列雜交,，Taq 酶的外切酶活性會(huì)切割探針,，使熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，釋放熒光信號(hào),，通過檢測(cè)熒光信號(hào)來判斷樣本中是否有瓜蔞子成分,。它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，分析靈敏性高，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng),。

3. 提供陽性對(duì)照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高,，引物是根據(jù)瓜蔞子DNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì),，不會(huì)跟其他的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng),。

5. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè),。用于定量時(shí)其線性范圍不少于 5 個(gè)數(shù)量級(jí),。

6. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研,。

規(guī)格及成分：

運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月,。
自備試劑 樣品 DNA,。

瓜蔞子探針法PCR鑒定試劑盒（不含內(nèi)參）使用方法：
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照,。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 6，5,，4,，3，2,，1,。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭,，下同）,。

3. 在 6 號(hào)管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

4. 換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

5. 換槍頭,，在 4 號(hào)管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

二,、樣品 DNA 的制備

7. 如果有 N 個(gè)樣品,，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對(duì)照）,，一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）,。可以用 10μL 上步所得 4 號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的起始體積一樣,，以此作為

PC,。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)樣品 DNA 提取試劑盒兼容,。也可以選購(gòu)本公司的免提取核酸釋放劑。

三,、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè)

用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板）,，1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（直接用第 6 步第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

11. 蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

四,、數(shù)據(jù)處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值,，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽性或陰性,，則陰性對(duì)照 Ct 必須沒有數(shù)值，或者 Ct 值等于或者大于 40,。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 40,。對(duì)待測(cè)樣品,，如果其 Ct 小于 40 則為陽性。如果沒有 Ct 值,，或大于或等于 40 則為陰性,。
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