牛結(jié)核?。═B）ELISA試劑盒

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期：6個(gè)月

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中牛結(jié)核?。═B）水平,。用純化的牛結(jié)核病（TB）抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入結(jié)核病（TB）,，再與HRP標(biāo)記的結(jié)核?。═B）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過徹-底洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的結(jié)核病（TB）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中牛結(jié)核病（TB）濃度,。 

試劑盒組成

130倍濃縮洗滌液20ml×1瓶7終止液6ml×1瓶

2酶標(biāo)試劑6ml×1瓶8標(biāo)準(zhǔn)品（32ng/L）0.5ml×1瓶

3酶標(biāo)包被板12孔×8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml×1瓶

4樣品稀釋液6ml×1瓶10說明書1份

5顯色劑A液6ml×1瓶11封板膜2張  

6顯色劑B液6ml×1/瓶12密封袋1個(gè)

操作步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

16ng/L5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

8ng/L4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

4ng/L3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2ng/L2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

1ng/L1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品150μl的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）,、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl,，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。   

4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5.洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次,，拍干,。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外,。 

7.溫育：操作同3,。

8.洗滌：操作同5。

9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10.終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

11.測(cè)定：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）,。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。

計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。 

注意事項(xiàng)

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差,。一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值）,，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。

5．封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。

6．底物請(qǐng)避光保存,。

7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

9．牛結(jié)核?。═B）ELISA試劑盒不同批號(hào)組分不得混用。