iPS細(xì)胞（STR鑒定）

細(xì)胞名稱：DYR0100

細(xì)胞描述：將人包皮細(xì)胞誘導(dǎo)成 iPS 細(xì)胞，通過重編程轉(zhuǎn)錄因子為：OCT4,、SOX2,、KLF4、

MYC 誘導(dǎo)建立 iPS 細(xì)胞,，培養(yǎng)時(shí)無需飼養(yǎng)層細(xì)胞,。

形 態(tài)：球形克隆

來源性別：男性疾 病：健康

年 齡：新生兒

細(xì)胞來源：從 ATCC 引進(jìn)

ATCC number: ACS-1011TM

凍存日期/代數(shù)：詳見 凍存管/培養(yǎng)瓶 標(biāo)識(shí)建議復(fù)蘇培養(yǎng)體系：1 個(gè) T25 培養(yǎng)瓶

細(xì)胞狀態(tài)：良好

支原體檢測(cè)結(jié)果：陰性

細(xì)胞用途：僅供科研使用,。

iPS細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞

1.試劑和材料

iPS細(xì)胞專用培養(yǎng)基試劑盒

所需的其它試劑和材料

2.培養(yǎng)流程

2.1試劑的制備

2.1.1 專用培養(yǎng)基制備

2.1.1在室溫（15-25℃）或冰箱內(nèi)（2-8℃）過夜解凍細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑,，可在無菌條件下將添加劑分裝為適量的工作等份，并在-20℃下凍存,。冷凍的分量須在3個(gè)月內(nèi)用完,。解凍后的分量應(yīng)該一天內(nèi)制備成專用培養(yǎng)基。請(qǐng)勿在解凍后再次冷凍,。

2.1.2.在無菌條件下將20mL的添加劑全部解凍后加入到500mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,，充分混勻。專用培養(yǎng)基在（2-8℃）下儲(chǔ)存時(shí)刻維持穩(wěn)定狀態(tài)最多2-3周,，或在-20℃下冷凍時(shí)刻維持穩(wěn)定狀態(tài)最多3個(gè)月,。在室溫（15-25℃）或冰箱內(nèi)（2-8℃）過夜解凍冷凍的培養(yǎng)基,，不要長(zhǎng)時(shí)間放在37℃水浴內(nèi)加熱培養(yǎng)基。

如果在無菌條件下制備,，細(xì)胞專用培養(yǎng)基可直接使用,。

2.1.2 Matrigel工作液的配制與包被

鑒于基質(zhì)膠的操作環(huán)境要求比較嚴(yán)格，為保證您的實(shí)驗(yàn)順利,，特此對(duì)以下幾個(gè)方面進(jìn)行溫馨提示：

1. 收貨時(shí),，首先確認(rèn)還有干冰，Matrigel成固態(tài),，液面水平,，如有異常請(qǐng)及時(shí)拍照取證并聯(lián)系我們。

2. 整個(gè)Matrigel只能分裝一次,，在分裝前,，要先放4℃冰箱（最好先把Matrigel插在冰上，然后放入4℃冰箱）過夜,，且分裝用的槍頭,、EP管等都要提前-20℃預(yù)冷（基質(zhì)膠在10℃以上會(huì)發(fā)成膠凝固導(dǎo)致基質(zhì)膠報(bào)廢），整個(gè)分裝過程都需在冰上進(jìn)行,，且以后每次試驗(yàn)時(shí)拿出本次用量所需的基質(zhì)膠,。

3. 實(shí)驗(yàn)人員手心不要接觸基質(zhì)膠，如：要手持裝有Matrigel的EP管的上方,，防止體溫使基質(zhì)膠成膠凝固,。 

4. Matrigel的稀釋比例建議為100倍稀釋。

本庫(kù)建議的配制Matrigel工作液方法：

1. 稀釋前將Matrigel放入4℃冰箱過夜融化,。

2. 將適量體積的稀釋液（DMEM/F12或PBS）置4℃冰箱預(yù)冷,。

3. 將融化的Matrigel與稀釋液從冰箱中取出并打開蓋子，用移液管吹吸稀釋液幾次以冷卻移液管,，并吸取少量稀釋液加入Matrigel管中混勻,，將Matrigel轉(zhuǎn)移到稀釋液中，并吹打混勻,。（因?yàn)?/span>Matrigel遇15℃以上溫度就會(huì)成凝膠粘在原裝玻璃壁和移液管壁上,，故Matrigel從冰箱拿出來以后盡快打開蓋子并轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的稀釋液中，吸取Matrigel的移液管一定要冷卻）,。

4. 立即用稀釋后的Matrigel包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿,。對(duì)于6孔板，每個(gè)孔使用1mL稀釋后的Matrigel,，對(duì)于6cm的培養(yǎng)皿,，每個(gè)孔使用2mL稀釋后的Matrigel，晃動(dòng)培養(yǎng)板使Matrigel溶液均勻的分布在表面上,。

5. 使用前,，包被的培養(yǎng)板應(yīng)放在培養(yǎng)箱（37℃）下至少1h,。請(qǐng)勿讓培養(yǎng)板脫水。在培養(yǎng)板可供使用之前,，請(qǐng)勿移除Matrigel溶液,。

如果不立即使用，培養(yǎng)板必須密封,，以防止脫水,。包被后的培養(yǎng)板可在2-8℃下最多儲(chǔ)存7天。

如果Matrigel溶液并未覆蓋表面,，則無法實(shí)驗(yàn)最佳的細(xì)胞培養(yǎng),，因此，不建議使用含有溶液已蒸發(fā)區(qū)域的培養(yǎng)板,。

如果已將培養(yǎng)板在2-8℃下儲(chǔ)存,，則在移除Matrigel溶液之前，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱（37℃）下放置30min,。

2.1.3 Y27632的配制

Y27632粉末溶解在PBS中,，配制成濃度未10mM的儲(chǔ)存液，0.22μm濾膜過濾除菌,。分裝后冷凍于-20℃。

Y27632提高復(fù)蘇和傳代后的克隆形成率,，所以只在復(fù)蘇和傳代步驟添加（1:1000,，即終濃度為10μM），換液時(shí)不添加,。

2.2.復(fù)蘇

在開始復(fù)蘇前,，將所有試管、預(yù)熱后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿準(zhǔn)備好,，已確保盡快完成復(fù)蘇過程,。

將凍存管從液氮中取出，快速在37℃水浴槽中解凍,，輕柔持續(xù)地?fù)u動(dòng)凍存管,，直到只剩下一個(gè)小冷凍團(tuán)。從水浴槽取出凍存管,，70%乙醇擦拭進(jìn)行消毒,。

使用移液管將凍存管中含有iPS細(xì)胞的凍存液輕輕轉(zhuǎn)移至一個(gè)含有5-6mL已經(jīng)預(yù)熱的專用培養(yǎng)基的15mL離心管中，過程必須輕柔防止吹散細(xì)胞團(tuán),。

室溫300g離心5min,。

吸出培養(yǎng)基，確保細(xì)胞團(tuán)完整,。

然后緩慢加入1mL專用培養(yǎng)基,，用手指輕彈離心管底部,，使細(xì)胞團(tuán)脫離底部并分散。

輕輕的將此1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至已包被的培養(yǎng)皿/板/瓶,，根據(jù)最終培養(yǎng)細(xì)胞的液體體積,，加入ROCK inhibitor Y27632，終濃度為10μM,。

將培養(yǎng)皿/板/瓶置于37℃培養(yǎng)箱中,，每天更換培養(yǎng)基（換液不需要再添加Y27632，但培養(yǎng)基需提前預(yù)熱）,。

2.3.傳代

當(dāng)集落變得較大,、中心變得密集、明亮（對(duì)比邊緣）,，相鄰的集落開始融合時(shí),，此時(shí)可進(jìn)行傳代。

傳代前,，準(zhǔn)備 37 ℃預(yù)熱好的無鈣鎂PBS 溶液及消化液,，專用培養(yǎng)基。

吸走上清,，并加入37℃預(yù)熱好的PBS 溶液清洗1次,。

加入適量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL,，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃預(yù)熱好的消化液,。

37℃放置1-2min，用手指輕彈皿/板/瓶身,，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底,，克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞成團(tuán)脫落。

加入適量的專用培養(yǎng)基終止消化,。

移入離心管,，300g離心5min。

離心后重懸（重懸步驟參照復(fù)蘇4-5步）,。

傳代比例為 1：6—1：8,，根據(jù)最終培養(yǎng)細(xì)胞的液體體積，加入ROCK inhibitor Y27632,，終濃度為10μM,。

將培養(yǎng)皿/板/瓶置于37℃培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)基（換液不需要再添加Y27632,，但培養(yǎng)基需提前預(yù)熱）,。

2.4.凍存

當(dāng)集落變得較大、中心變得密集、明亮（對(duì)比邊緣）,，相鄰的集落開始融合時(shí),，此時(shí)可進(jìn)行傳代。

傳代前,，準(zhǔn)備37 ℃預(yù)熱好的無鈣鎂 PBS 溶液及消化液,，專用培養(yǎng)基。

吸走上清,，并加入37℃預(yù)熱好的 PBS 溶液清洗1次,。

加入適量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL,，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃預(yù)熱好的消化液,。

37℃放置1-2min，用手指輕彈皿/板/瓶身,，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底,，克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞成團(tuán)脫落。

加入適量的專用培養(yǎng)基終止消化,。

移入離心管,，300g離心5min。

離心后重懸（重懸步驟參照復(fù)蘇4-5步）,。

使用預(yù)冷的凍存液輕輕的重懸細(xì)胞團(tuán),，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管，凍存按 6 孔板每孔凍 1 支,，6cm 皿凍 2-4 支,，10cm 皿凍 6-12 支。

iPS細(xì)胞（STR鑒定）