谷an酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測定試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

谷an酰胺酶活性測定試劑盒 氮代謝

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

GLS（EC 3.5.1.1）是酰胺基水解酶,，催化天dong酰胺水解成谷an酸氨，在氮素代謝中具有重要調控作用,，尤其是調節(jié)游離氨含量和尿素代謝,。

測定原理：

GLS 催化谷an酰胺水解成 L-谷an酸氨，利用奈氏試劑檢測氨增加的速率,，即可計算其酶活性。

組成：

自備儀器和用品：

臺式離心機,、可見分光光度計,、水浴鍋、1ml 玻璃比色皿,、可調式移液槍,、研缽、冰和蒸餾水,。

粗酶液提?。?/span>

1、細菌,、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內,，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量

（104 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 試劑一）,，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復 30 次）；

8000g4℃離心 10min,，取上清,，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g組織,，加入 1ml 試劑一）,，進行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心 10min，取上清,，置冰上待測,。

2、血清（漿）樣品：直接檢測,。

測定步驟：

1,、分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 420nm,，蒸餾水調零,。

2、樣品測定（在 EP 中加入下列試劑）：

混勻,，37℃水浴 1 小時

混勻,，8000 g，25℃離心 10 min,；取上清液,，在EP 管中加入下列試劑

混勻，室溫靜置 15min,，420nm 處讀取吸光值A,，計算ΔA=A 測定管-A 對照管。對照管只要做一管,。

注意：

1,、試劑六如出現(xiàn)沉淀，靜置后取上清使用,。

2,、ΔA（A 測定管-A 對照管）若出現(xiàn)負值，可能是酶活性較低,，可將反應時間 1h 延長到 2h,，相應的在計算公式中除以 2。

酶活性計算：

標準條件下測定的回歸方程為y =3.8488x +0.0057,，R2 = 0.9983,；x 為標準品濃度（μmol/ml），y 為吸光值A,。

1,、血清（漿）GLS 活性

單位定義：每ml 血清（漿）每min 催化谷an酰胺生成 1nmol 氨定義為一個酶活力單位。GLS（nmol /min/ml）＝ (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反總÷V 樣÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)

2,、組織,、細菌或細胞 GLS 活性

按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每mg 蛋白質每min 催化谷an酰胺生成 1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS（nmol /min /mg prot）＝ (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位定義：每g 組織每min 催化谷an酰胺生成 1nmol 氨定義為一個酶活力單位,。

GLS（nmol/min/g 鮮重）＝(ΔA-0.0057)÷3.8488×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T×1000

=181.8×(ΔA -0.0057)÷W

按細菌或細胞密度計算

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每min 催化谷an酰胺生成 1nmol 氨定義為一個酶活力單位,。GLS

（nmol/min/104 cell）＝(ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反總÷(500× V 樣÷V 樣總)÷T×1000

=0.3637×(ΔA-0.0057)

V 樣總：加入提取液體積,，1 ml；T：反應時間,，60min,；V 反總：反應體系總體積，1.05ml,；V 樣：加入反應體系中樣本體積,，0.025ml；Cpr：樣本蛋白質濃度,，mg/ml,；W：樣本質量，g,；500：細菌或細胞總數(shù),， 500 萬; 1000，μmol 到nmol 換算系數(shù),。

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