產(chǎn)品簡介：

芽孢桿菌（Bacillus）屬于芽孢桿菌科芽孢桿菌屬,，為革蘭氏陽性菌。細(xì)胞呈直     桿狀,，常以成對或鏈狀排列,，具圓端或方端。芽孢桿菌對外界有害因子抵抗力強(qiáng),、分  布廣,，存在于土壤、水,、空氣以及動物腸道等處,，在工農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥生產(chǎn)中均有廣泛應(yīng)  用，因此快速檢測芽孢桿菌具有重要意義,。為此本公司以探針法 qPCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了芽孢桿菌的檢測試劑盒,。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏度高，最-低檢測限可達(dá) 100 拷貝/反應(yīng),。

3.提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高,，引物是根據(jù)芽孢桿菌基因組 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計,，可以檢測本屬的主要物種，不會跟其它生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng),。

5.既可用于定性檢測,，又可用于定量檢測。用于定量檢測時,，線性范圍至少 5 個數(shù)量級,。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

7.芽孢桿菌通用探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研,。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒,，可滿足一定規(guī)模的檢測需求。

檢測方法

實時熒光PCR,，具有快速,、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix,、熒光 PCR 專用模板稀釋液,、超純水、芽孢桿菌通用 qPCR 引物-探針干粉,、芽孢桿菌通用 qPCR 陽性對照(1E7 拷貝/μL),、使用手冊。

自備試劑

樣品 DNA,，超純水,，核酸純化試劑盒。

保存和運輸

低溫運輸,，-20℃保存,，保存期限為 24 個月。

使用方法：

一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。

由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能  污染樣品或本試劑盒的其他成分,。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供 DNA 片段作為陽性對照,。

1.標(biāo)記 6 個離心管,，分別為 6、5,、4,、3、2,、1,。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭（下同）,。

3.在 6 號管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),，充分震蕩混勻 1分鐘，得到 1E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩混勻 1 分鐘,，得到 1E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

5.換槍頭,，在 4 號管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步所得),，充分震蕩混勻 1 分鐘,，得到 1E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

6.依次重復(fù)上面的操作得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品,，最好設(shè)置 N+2 個提取,，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對

照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）,?？梢杂?10 μL 上步所得 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC,。另外用水作為 NC,。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)樣品 DNA- 提取試劑盒兼容,。也可以選購本公司的核酸-提取試劑,。

三、qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，1 個用于 PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè)

置完畢后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最  后加）：

成分樣品管

N+3 個PCR 陰性

對照管標(biāo)曲樣品管

（1-6）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

芽孢桿菌通用 qPCR 引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

待測樣本 DNA 模板7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（1-6 號）

不加

不加各 7 μL（1 號樣到 1 號管，2 號樣到 2 號管…）

四,、數(shù)據(jù)處理

12.如果擴(kuò)增陽性對照或制備陽性對照結(jié)果為陰性,，則整個擴(kuò)增或制備實驗無效，不  需要分析數(shù)據(jù),，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系,。如果擴(kuò)增陰性對照或制備陰  性對照結(jié)果為陽性,，說明環(huán)境污染，則整個擴(kuò)增或制備實驗無效,，不需要分析數(shù)  據(jù),，需要跟廠家聯(lián)系，購買新的引物和探針,。

13.如果陰性對照和陽性對照正常,，則實驗有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析,。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無 Ct 或 Ct 大于或等于 40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 40,，否則實驗無效,。如果實驗有效，則分析待測樣品,，如果無 Ct 或 Ct 大于或等于 40,，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽性,。

選擇我們的芽孢桿菌通用探針法熒光PCR試劑盒,，就是選擇精準(zhǔn)、高效,、可靠的檢測方案,，為您的科研實驗保駕護(hù)航！