產品簡介：

巴貝斯蟲屬（Babesia spp.）主要是通過蜱蟲傳播寄生于動物宿主紅細胞內的原蟲，它主要引起人和動物的巴貝蟲病,，屬于人獸共染的寄生蟲病,。人巴貝蟲病，急性發(fā)病時頗似瘧疾,，臨床以間歇熱,、脾大、黃疸及溶血等為特征,。目前已經有 100 種以上的巴貝斯蟲得到鑒定,，是人和動物健康的重大威脅，因此快速檢測巴貝斯蟲具有重要的意義,。本產品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發(fā)的專門檢測巴貝斯蟲的通用的試劑盒,。

產品特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2.引物和探針經過優(yōu)化,，分析靈敏度高，可以達到 100 拷貝/反應,。

3.提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高,，引物是根據巴貝斯屬通用 DNA 高度保守區(qū)設計,，不會跟其他生物的 DNA 發(fā)生交叉反應。

5.In silico 分析發(fā)現本產品可以檢測 B. venatorum,、B. divergens,、B. capreoli 和 B.canis 等大巴貝斯，但不能檢測 B. microti,。

6.既用于定性檢測,，又用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少 5 個數量級,。

7.本產品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法熒光定量PCR 反應,。

8.巴貝斯屬通用探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產品參數：

產品規(guī)格

50T/盒,，可滿足一定規(guī)模的檢測需求,。

檢測方法

實時熒光PCR，具有快速,、準確,、靈敏等優(yōu)點。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix,、熒光 PCR 專用模板稀釋液,、超純水,、巴貝斯屬通用 qPCR 引物-探針干粉、巴貝斯屬通用 qPCR 陽性對照(1E7 拷貝/μL),、使用手冊,。

自備試劑

樣品 DNA，超純水,，核酸純化試劑盒,。

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存,，保存期限為 24 個月,。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）,。由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,，本

產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照,。

1.標記 6 個離心管,，分別為 6、5,、4,、3、2,、1,。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭,，下同）,。

3.在 6 號管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1

分鐘,，得 1E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。

4.換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。

5.換槍頭,，在 4 號管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用,。

6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品,。放冰上待用。

二,、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品,，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性

對照）,，一個是 NC（樣品制備陰性對照）,。可以用 10 μL 上步所得 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為 PC 另外用水作為 NC,。

8.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數樣品 DNA -提取試劑盒兼容,。也可以選購本公司的核酸-提取試劑,。

三、Probe qPCR 反應（20 μL 體系,，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復,，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復,，則標記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于PCR 陰性對照（用水做模板）,，1 個用于 PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復,。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好

后最后加）：

成分樣品管

N+2 個PCR 陰性

對照標準曲線樣品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

巴貝斯屬通用 qPCR

引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 個待測 DNA 樣本各 7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液

（1-6 號）

不加

不加各 7 μL（2 號樣到 2 號管，3

號樣到 3 號

管…）

四,、數據處理

12.如果樣本制備陽性對照或PCR 陽性對照(包括標曲樣本)結果為陰性,，則整個實驗無效，不需要分析數據,，需要重新樣本制備,，重新進行 PCR 擴增或跟廠家聯系。如果樣本制備陰性對照或 PCR 陰性對照結果為陽性，說明環(huán)境污染,，則整個實驗無效,，不需要分析數據，需要跟廠家聯系,。

13.如果陰性對照和陽性對照均正常,，則實驗有效，可以進入后續(xù)分析,。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸,，繪制標準曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無 Ct 或 Ct 大于或等于 40,。陽性對照必須有熒光對數增長,，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于 40,，否則實驗無效,。如果實驗有效，則分析待測樣品,，如果無 Ct 或 Ct 大于

或等于 40,，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽,。

選擇我們的巴貝斯屬通用探針法熒光PCR試劑盒,，就是選擇精準、高效,、可靠的檢測方案,，為您的科研實驗保駕護航！