產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

立克次體 (Rickettsias) 是一大類專性真核細(xì)胞內(nèi)寄生的原核微生物,，常呈多形性,，革蘭氏陰性。多種立克次體是重要的人獸共患病原體,，可通過(guò)媒介昆蟲的叮咬和排泄物,、   或氣溶膠進(jìn)行傳播,，廣泛分布于世界各地。常見的立克次體疾病主要有斑疹傷寒,、斑點(diǎn)熱,、恙蟲病、Q 熱,，其對(duì)應(yīng)的病原體分別為斑疹傷寒群立克次體 (Typhus Group Rickettsiae,，TGＲ)、斑點(diǎn)熱群立克次體(Spotted Fever Group Rickettsiae,，SFGR) ,、恙蟲病東方體（Orientiatsutsugamushi，Ot) 和貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii,，Cb) ,。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)上述四種之一的斑點(diǎn)熱群立克次體通用的試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板,。

2.引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分析靈敏度高,，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)。

3.提供陽(yáng)性對(duì)照,，便于區(qū)分假陰性樣品,。

4.特異性高，引物是根據(jù)斑點(diǎn)熱群立克次氏體 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì),，不會(huì)跟其他生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng),。

5.insilico分析發(fā)現(xiàn)本產(chǎn)品可以檢測(cè)R.rickettsii、R.heilongjiangensis,、R.sibirica,、                                       R.raoultii、R.conori和R.montana這些屬于 SFGR 的立克次氏體,。

6.既可用于定性檢測(cè),，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為 5 個(gè)數(shù)量級(jí),。

7.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng),。

8.斑點(diǎn)熱群立克次氏體探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒,，可滿足一定規(guī)模的檢測(cè)需求,。

檢測(cè)方法

實(shí)時(shí)熒光PCR，具有快速,、準(zhǔn)確,、靈敏等優(yōu)點(diǎn),。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專用模板稀釋液,、超純水,、斑點(diǎn)熱群立克次氏體 qPCR 引物-探針干粉、斑點(diǎn)熱群立克次氏體 陽(yáng)性對(duì)照(1E7 拷貝/μL),、使用手冊(cè),。

自備試劑

樣品 DNA。

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸,，-20℃保存,，保存期限為 24 個(gè)月。

使用方法：

一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑

盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照,。

1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6,、5,、4、3,、2,、1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,，最好用帶芯槍頭,，下同）。

3.在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

4.換槍頭,，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

二,、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品,，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照）,，

一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）,。可以用 10 μL 上步所得 4 號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣,，以此作為 PC,。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)樣品 DNA-提取試劑盒兼容,。也可以選購(gòu)本公司的核酸-提取試劑。

三,、Probe qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管,，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（直接用第 6 步第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）,。下面只以定量分析為例描述操作步驟,。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢

后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

成分樣品管

N+2 個(gè)PCR 陰性

對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

斑點(diǎn)熱群立克次氏體 qPCR

引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 個(gè)待測(cè) DNA 樣本各 7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液

（1-6 號(hào)）

不加

不加各 7 μL（2 號(hào)樣

到 2 號(hào)管,，3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…）

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：

四,、數(shù)據(jù)處理

12.如果樣本制備陽(yáng)性對(duì)照或 PCR 陽(yáng)性對(duì)照(包括標(biāo)曲樣本)結(jié)果為陰性,，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備,，重新進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或跟廠家聯(lián)系,。如果樣本制備陰性對(duì)照或 PCR 陰性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明環(huán)境污染,，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效,， 不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系,。

13.如果陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均正常,，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析,。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸,， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值， 再推算出其濃度,。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照必須無(wú) Ct 或 Ct 大于或等于 40,。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 40,， 否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效,。如果實(shí)驗(yàn)有效，則分析待測(cè)樣品,，如果無(wú) Ct 或 Ct 大于或等于 40,，則為陰性。如果 Ct 小于 40 則為陽(yáng)性,。

選擇我們的斑點(diǎn)熱群立克次氏體探針法熒光PCR試劑盒,，就是選擇精準(zhǔn)、高效,、可靠的檢測(cè)方案,，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！