人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基

由Nexell技術(shù)團隊精心優(yōu)化的人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，經(jīng)篩選配比的無血清添加物及其他輔助成分,。該產(chǎn)品適用于人間質(zhì)干細胞無血清條件的培養(yǎng),；可維持人間質(zhì)干細胞良好的增殖速率，并保持良好的分化能力,。

實驗數(shù)據(jù)：

1.使用Nexell的間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞,，細胞表型如何？

用流式細胞儀檢測細胞表面抗原：CD19(0.35%),、CD34(1.23%),、CD45(1.08%)呈陰性表達；CD90(99.94%),、CD105(97.02%)呈陽性表達,。

2.通過臍帶組織貼塊法分離間充質(zhì)干細胞需要幾天？

7-10天,，可見細胞爬出,；第14天，細胞可傳代,；之后,，每2-3天細胞可傳代一次,。

【產(chǎn)品用途與描述】

間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基可用于多種來源的人類間充質(zhì)干細胞的原代細胞分離及細胞傳代培養(yǎng)，同時還能保持其多向分化的潛能,，如人骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-hMSC),、人脂肪間充質(zhì)干細胞（AT-hMSC）、人臍帶間充質(zhì)干細胞（UCM-hMSC）等,。

使用本產(chǎn)品無需添加血清或血清替代物,。

間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基化學(xué)成分明確、無血清,、無動物源成分,。產(chǎn)品批間差異小，非常適用于培養(yǎng)哺乳類干細胞,，包括臍帶干細胞,，骨髓干細胞，脂肪干細胞等間充質(zhì)干細胞,。產(chǎn)品嚴格無菌,，無病毒和支原體，性能穩(wěn)定,，使用該培養(yǎng)基能使干細胞在理想營養(yǎng)平衡狀態(tài)下進行多代擴增而不發(fā)生分化（10代以內(nèi)）,。

【產(chǎn)品特點】

1、可維持人類間充質(zhì)干細胞良好的增值速率,；

2,、保持良好的分化能力；

3,、經(jīng)過微生物檢測（細菌,、真菌、霉菌及支原體）,、PH檢測,、滲透壓和內(nèi)毒素檢測；

4,、不含任何動物源的蛋白成分,。

【產(chǎn)品規(guī)格與保存】

【產(chǎn)品穩(wěn)定性】

1,、所有的產(chǎn)品都需要避光保存；

2,、所有產(chǎn)品一旦超過標(biāo)簽注釋的有效期,，必須放棄使用；

3、配制成培養(yǎng)基后,，避光保存在2-8℃可存放3-4周,；

4、為了更好的使用效果,，請勿對試劑進行反復(fù)凍融,。

【產(chǎn)品主要成份】

間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基的主要組成成分：氨基酸，維生素,、無機鹽,、白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白,、胰島素,、微量元素等。

【產(chǎn)品使用方法】

1,、人間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基準備

將間充質(zhì)干細胞無血清生長添加劑(MSCGs)在2-8℃過夜融化,，按1:100比例加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，即成為間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基,。

溫馨提示：間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基2-8℃避光條件下,，可保存30天。若小量,、多次使用,，建議您將間充質(zhì)干細胞無血清生長添加劑(MSCGs)分裝后，保存于-20℃冰箱,，可避免培養(yǎng)基不必要的浪費。

2,、人間充質(zhì)干細胞復(fù)蘇（以T-75瓶為例）

①從冰箱中取出培養(yǎng)基,，在生物安全柜或超凈臺中吸取適量（如T-75瓶：10-15mL)培養(yǎng)基沿上表面加入間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)瓶中，切勿沖到細胞培養(yǎng)瓶底面,，即：細胞生長面,。然后慢慢將細胞培養(yǎng)瓶平放，在37℃,、恒溫CO2培養(yǎng)箱中放置5-10分鐘后使用,。

溫馨提示：請嚴格按照此步驟操作，否則可能會出現(xiàn)細胞培養(yǎng)瓶中細胞生長空白區(qū)域,，即所謂的“生長空洞”,。多數(shù)用戶使用的不是專用的預(yù)包被細胞培養(yǎng)瓶，而是普通的細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿,，其表面環(huán)境并不利于無血清培養(yǎng)環(huán)境下的間充質(zhì)干細胞貼壁,。37℃放置5-10分鐘，可讓培養(yǎng)基中的促貼壁物質(zhì)更好地與細胞培養(yǎng)瓶底部結(jié)合，使得間充質(zhì)干細胞的貼壁能力增強,，降低“生長空洞”出現(xiàn)的概率。

②從液氮中取出凍存的間充質(zhì)干細胞,，迅速將凍存管放入37℃水浴中,，快速融解。

溫馨提示：盡可能避免水沒過管帽,，以減少污染的風(fēng)險,；要快速完成細胞復(fù)蘇過程（盡量控制在1分鐘內(nèi)），融化過程時間過長,，會造成復(fù)蘇后細胞活性較差,。

③用70%-75%酒精消毒凍存管外壁，在生物安全柜或超凈臺中打開凍存管,，用吸管/移液器將細胞凍存懸液緩慢移入裝有5-10mL細胞培養(yǎng)基的15mL離心管中（在這一過程請盡可能避免產(chǎn)生氣泡）,。

溫馨提示：為了減少細胞損失,，往細胞凍存管中加入1mL培養(yǎng)基,，稍微吹打,，用吸管/移液器將這1mL的細胞懸液吸入離心管中,，再用吸管/移液器將離心管中的細胞輕輕吹打混勻,。

④1200rpm離心5min，棄上清,，加入2mL培養(yǎng)基重懸細胞，臺盼藍染色計數(shù),，按密度2×10⁴cells/cm²將細胞接種至步驟①中孵育完的細胞培養(yǎng)瓶中，添加細胞時,，將細胞培養(yǎng)瓶豎立,，細胞懸液直接加到底部，切忌沖到細胞培養(yǎng)瓶底面,。

⑤輕輕搖晃細胞培養(yǎng)器皿,，使細胞均勻分布，混勻后,，置于37℃,、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

⑥24h后,，更換新鮮的培養(yǎng)基（溫育至37℃）。

3,、人間充質(zhì)干細胞傳代（以T-75瓶為例）

①在顯微鏡下觀察細胞,，當(dāng)細胞融合度達到80-90%，即可傳代,。

溫馨提示：細胞融合度請勿超過90%,。很多傳代后的細胞大比例死亡，是由于傳代前細胞生長過密（融合度過高）,，導(dǎo)致細胞消化異常（細胞整片或成片脫落）,，加之隨后的不當(dāng)操作（如用移液器反復(fù)吹打成片細胞使其成為單個細胞），此機械損失過程會嚴重損害細胞膜,，引發(fā)大比例的細胞死亡,；間充質(zhì)干細胞經(jīng)凍存后再次使用時，尤為明顯,。

②預(yù)處理細胞培養(yǎng)瓶,，處理方法同細胞復(fù)蘇中的步驟①。

③在生物安全柜或超凈臺中,，棄去細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,，加入5-10mL PBS清洗細胞后棄去，再加入2mL 0.05%胰酶-EDTA消化細胞,。

④在顯微鏡下觀察到細胞變圓時,，立即加入5mL胰酶抑制劑終止消化。

⑤用移液器輕輕吹打瓶壁上還未脫離的細胞,，并輕輕吹打混勻,，使細胞分散。

⑥將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中,，1200rpm離心5min。棄上清,，加入2mL細胞培養(yǎng)基重懸細胞,，臺盼藍染色計數(shù)，按細胞密度2×10⁴cells/cm²,，將細胞接種至細胞傳代②步驟中孵育完的細胞培養(yǎng)瓶中,，添加細胞時，將細胞培養(yǎng)瓶豎立,，細胞懸液直接加到底部,，切忌沖到細胞培養(yǎng)瓶底面。

⑦輕輕搖晃細胞培養(yǎng)器皿，使細胞均勻分布,，混勻后,，置于37℃、5%CO2,、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),。

4、人間充質(zhì)干細胞凍存

①用0.05%胰酶-EDTA消化待凍存的細胞,，加入胰酶抑制劑終止消化并離心,，重懸后進行細胞計數(shù)。

②1200rpm離心5min,，棄上清,。

③根據(jù)細胞計數(shù)情況，緩慢加入適量冷的無血清凍存液（無血清凍存液可即拿即用或置于冰袋備用）,，調(diào)整細胞密度在1×10⁶cells/mL左右,。

④輕輕地重懸細胞，將重懸均勻的細胞按等份加入到滅菌的凍存管中（需提前做好標(biāo)記）,，旋緊凍存管蓋,。

⑤迅速將凍存管放入程序降溫盒中，然后將凍存盒直接放入-80℃冰箱,。

⑥過夜放置后,，將細胞從-80℃冰箱轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。