諾博萊德 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt

His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子）輔助試劑

產(chǎn)品貨號：M0198

產(chǎn)品名稱：His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt

產(chǎn)品規(guī)格：5mL/2×50mL

產(chǎn)品簡介：

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderM0198 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt具有超順磁性，專為高效,、快速純化組an酸標(biāo)簽蛋白而設(shè)計的一種新型功能化材料?？赏ㄟ^磁性分離方式直接從生物樣品中一步純化出高純度的目標(biāo)蛋白,，極大地簡化純化工藝和提高純化效率，適合科研和工業(yè)領(lǐng)域便捷地進行組an酸標(biāo)簽蛋白純化,。

與傳統(tǒng)層析方式使用的金屬螯合瓊脂糖預(yù)裝柱相比,，采用磁珠純化組an酸標(biāo)簽蛋白，無需對樣品進行多次長時間的高速離心和濾膜過濾,、無需控制流速,、更無需高昂的層析設(shè)備。樣品與磁珠的特異性結(jié)合,、洗滌以及目標(biāo)蛋白的洗脫變得簡單,、快速、易操作。對于熟練的操作者而言,，在 1h 內(nèi)就能獲得高純度的目標(biāo)蛋白,，且能輕松實現(xiàn)高通量和大規(guī)模樣品的平行處理，為研究者節(jié)省了時間和成本,。

本產(chǎn)品系列包括鎳離子（Nickel）,、鈷離子（Cobalt）兩種金屬離子螯合磁珠，它們在目標(biāo)蛋白結(jié)合量和非特異性吸附等性能上有所區(qū)別,，用戶可根據(jù)目標(biāo)蛋白與不同種類金屬的結(jié)合性能,，以及對目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量和純度的要求，選擇不同種類的金屬離子螯合磁珠,。

適用范圍：

適用于純化細菌,、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞等分泌或胞內(nèi)表達的可溶性組an酸標(biāo)簽蛋白,，也可用于變性蛋白的純化（包涵體需變性后再進行純化）,。

操作步驟：（僅供參考）

1、緩沖液的準(zhǔn)備

目標(biāo)蛋白與組an酸標(biāo)簽蛋白純化磁珠的結(jié)合性能將直接影響目標(biāo)蛋白的純化效率,，而各種緩沖液配制也將在一定程度上影響目標(biāo)蛋白的回收率和純度,。因此，在較大規(guī)模蛋白純化之前,，用戶應(yīng)該自行設(shè)計實驗,，篩選出適合純化目標(biāo)蛋白的緩沖液體系，主要包括 BindingBuffer,、WashingBuffer,、Elution Buffer。

增加咪唑濃度進行洗脫是組an酸標(biāo)簽純化磁珠*chang用的洗脫方法,，shou次使用時,，在不確定最佳的洗脫咪 唑濃度情況下，推薦在緩沖液中分別加入 10mM,、20mM,、50mM、100mM,、200mM,、300 mM、400mM,、500mM mi唑,，濃度從低到高分別洗脫，磁吸后收集蛋白上清液,，之后通過 SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結(jié)果,。

以下提供的緩沖液體系適用于多數(shù)組an酸標(biāo)簽蛋白的純化,，供用戶參考。

Binding Buffer： 20 mMPhosphateBuffer,，500mMNaCl,，5~50mMImidazole，pH7.4

 Washing Buffer： 20mMPhosphateBuffer,，500mMNaCl,，50~100mMImidazole，pH7.4

 Elution Buffer： 20 mMPhosphateBuffer,，500 mMNaCl,，500mMImidazole，pH7.4

 2,、樣本處理

（1）大腸桿菌,、酵母等細胞內(nèi)表達蛋白：表達細胞用適量的 BindingBuffer 稀釋，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為 1mM 的 PMSF）,，重懸細胞,，冰浴超聲裂解細胞，即為粗蛋白樣品,。如果樣品過于粘稠,，可根據(jù)需要在粗樣品中加入適量核酸酶，冰浴 30min,，以降解核酸,。另外，用戶也可以根據(jù)實際需要對蛋白樣品進行離心操作,。

（2）胞外表達蛋白：取胞外表達上清,，用等量 BindingBuffer 稀釋，即為粗蛋白樣品,。

（3）動物細胞胞內(nèi)表達蛋白：取適量動物細胞,，先用適量 PBS 洗滌 1 次，棄上清,；接著用適量含 1%（v/v） TritonX-100 或 1%（v/v） NP-40 的BindingBuffer 重懸,，加入蛋白酶抑制劑（如終濃度為 1mM 的 PMSF），冰浴10min,，即為粗蛋白樣品。

3,、磁珠預(yù)處理

一般情況下,，磁珠的使用量是由用戶根據(jù)目標(biāo)蛋白產(chǎn)量和磁珠載量信息計算獲得。例如：采用大腸桿菌表達某目標(biāo)蛋白,，500mL 發(fā)酵液收獲 2g 濕重的菌體,，通過預(yù)實驗估算其目標(biāo)蛋白產(chǎn)量為 10～20 mg,，用戶需要取 5mL 磁珠懸液用于目標(biāo)蛋白的純化。以下即以此為例進行詳細說明：

（1）將磁珠產(chǎn)品置于漩渦混勻器上充分混勻,，用移液器取 5mL 磁珠懸液于 15mL 離心管中,，進行磁性分離*， 棄上清液,，從磁性分離器上取下離心管,。

（2）加入 5mLBindingBuffer 到上述裝有磁珠的離心管中，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,，使磁珠重新懸?。贿M行磁性分離,，移去上清液,。重復(fù)洗滌 2 次。

（*：在磁性分離過程中,，為了減少磁珠在使用過程中的損耗,，待溶液變澄清后，蓋緊離心管蓋子,，保持離心管 仍在磁性分離器上,，手持磁性分離器與離心管上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使澄清的溶液涮洗離心管蓋上殘留的磁珠,，靜置片刻,， 使溶液重新變澄清；以下同,。）

4,、目標(biāo)蛋白與磁珠結(jié)合

（1）用 10mLBindingBuffer 懸浮 2g 濕重的菌體，進行破碎和裂解之后,，即為目標(biāo)粗蛋白樣品,，加入到裝有預(yù)處理磁珠的離心管中，將離心管置于漩渦混勻器振蕩 15s,。

（2）將離心管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上,，室溫旋轉(zhuǎn)混合 20~30min（如果需要，可以在 2~8℃ 的低溫環(huán)境下,，旋轉(zhuǎn)混 1h,， 防止目標(biāo)蛋白降解）。

（3）將離心管置于磁性分離器上進行磁性分離,，移出上清液至新的離心管中以備后續(xù)檢測,，從磁性分離器上取下離心管進行后續(xù)洗滌步驟。

5,、磁珠洗滌

（1）加入 10mLWashingBuffer 到裝有磁珠的離心管中,，輕輕翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,，使磁珠重新懸浮，磁性分離,，移出清洗液到新的離心管中,，以備取樣檢測。重復(fù)此步驟 1 次,。

（2）加入 10mLWashingBuffer 到裝有磁珠的離心管,，使磁珠重新懸浮，將磁珠懸液轉(zhuǎn)移到新的離心管（避免原離心管壁上非特異性吸附蛋白污染目標(biāo)蛋白）,，磁性分離,，移出上清液到清洗液收集管。

6,、目標(biāo)蛋白洗脫

（1）用戶可根據(jù)需要改變洗脫體積調(diào)整目標(biāo)蛋白濃度,，加入 2~10mLElutionBuffer，輕輕翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,，使磁珠懸浮,，磁性分離，收集洗脫液到新的離心管中,，即為純化的目標(biāo)蛋白樣品,。

（2）如果需要，可以重復(fù)上述步驟 1 次,，收集樣品到新的離心管中,，以檢測目標(biāo)蛋白是否洗脫wan全。

7,、磁珠后處理

（1）在裝有磁珠的離心管中加入 5mLElutionBuffer,，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸浮,，磁性分離,， 去除上清液。

（2）重復(fù)上述步驟 2 次,。

（3）在離心管中加入 5mLddH2O,，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸浮,，磁性分離,，去除上清液。

（4）重復(fù)上述步驟 2 次,。

（5）加入 StorageBuffer 到磁珠中使總體積為 5mL,，保存于 2~30℃（長期保存，置于 2~8℃）,，可用于下一次同種蛋白的純化,。

8、磁珠再生

磁珠連續(xù)使用三次以上,，其結(jié)合目標(biāo)蛋白的能力可能會明顯降低,，建議進行磁珠再生處理。

Stripping Buffer：20 mM SodiumPhosphate,，500mMNaCl,，100mMEDTA， pH7.4

BeadsWashing Buffer（可選）：0.5MNaOH,，2MNaCl

Recharge Buffer：100 mMNiSO4/ CoCl2 （該化學(xué)試劑具有一定的毒性,，可能造成過敏反應(yīng)，使用時務(wù)必注意自身安全）

Storage Buffer：20%（v/v）乙醇

以 5mL10%（v/v）磁珠懸液為例,，詳細說明磁珠再生操作：

（1）將磁珠懸液進行磁性分離,，去除上清液，從磁性分離器上取下離心管,，在離心管中加入 5mLddH2O,， 上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮,，磁性分離,，去除上清液。

（2）加入 5mLStrippingBuffer,，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 5min,，磁性分離,，去除上清液。重復(fù)此步驟 1 次,。

（3）加入 5mLddH2O,，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮,，磁性分離,，去除上清液，重復(fù)

此步驟 2 次,。

（4）堿處理：加入 5mLBeadsWashingBuffer,，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮,，室溫旋轉(zhuǎn)混合 5min,，磁性分離，去除上清液,。加入 5mLddH2O,，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,，使磁珠重新懸浮，磁性分離,，去除上清液,。重復(fù) ddH2O 洗滌步驟 3~5 次，至洗滌液呈中性為止,。

（5）加入 5mLRechargeBuffer,，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮,，室溫旋轉(zhuǎn)混合 20min,，磁性分離，去除上清液,。

（6）加入 5mLddH2O,，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮,，磁性分離,，去除上清液。重復(fù)此步驟 4 次以上,，保證鎳離子去除wan全,。

（7）加入 StorageBuffer 到磁珠中使總體積為 5mL，保存于 2~30℃ （長期保存,，置于 2~8℃）

蛋白純化流程的優(yōu)化

以上操作流程適用于大部分組an酸標(biāo)簽蛋白的純化,，根據(jù)目標(biāo)蛋白與金屬離子螯合磁珠的結(jié)合性能不同， 用戶可以從以下幾個方面對純化流程進行優(yōu)化,，以提高目標(biāo)蛋白的回收率和純度,。

提高目標(biāo)蛋白回收率的參考方法：

（1）降低樣品溶液和BindingBuffer 中的 Imidazole 濃度；

（2）樣品溶液和其它緩沖液中添加表面活性劑等物質(zhì),；

（3）添加合適的蛋白酶抑制劑,，防止目標(biāo)蛋白降解；

（4）增加磁珠用量,；

（5）延長蛋白與磁珠孵育的時間,；

（6）延長洗脫目標(biāo)蛋白的時間或增加洗脫次數(shù)。

提高目標(biāo)蛋白純度的參考方法：

（1）提高樣品溶液和BindingBuffer 中 Imidazole,、NaCl 的濃度,；

（2）樣品和緩沖液中添加表面活性劑等物質(zhì)；

（3）添加合適的蛋白酶抑制劑,，防止目標(biāo)蛋白降解,；

（4）延長洗滌的時間，增加洗滌次數(shù)；

（5）采用梯度 Imidazole 濃度洗脫目標(biāo)蛋白,。

注意事項

1,、shou次使用本產(chǎn)品前，請務(wù)必詳細閱讀本用戶手冊,；

2,、磁珠使用和保存過程中應(yīng)避免冷凍、干燥和高速離心等操作,；

3、在使用本產(chǎn)品前,，請務(wù)必充分振蕩使磁珠保持均勻的懸浮狀態(tài),；

4、請選用質(zhì)量好的移液器吸頭和離心管,，以免磁珠貼壁或混合過程發(fā)生滲漏引起磁珠的損耗,；

5、磁珠與溶液混合過程中,，如果溶液粘稠無法通過翻轉(zhuǎn)離心管重懸磁珠,，可采用移液器反復(fù)吹吸或短時漩渦混合使磁珠充分重懸；

6,、用戶可根據(jù)實際需要保留經(jīng)磁性分離移去的上清液,，進行取樣檢測，以便分析純化過程和優(yōu)化蛋白純化流程,；

7,、本產(chǎn)品可以重復(fù)使用，當(dāng)純化性能降低時,，建議進行再生處理,；

8、使用過的磁珠重復(fù)使用時,，建議純化同種蛋白,，純化不同種類的蛋白時，建議使用新的磁珠,；

9,、本產(chǎn)品需與磁性分離器配套使用；

10,、本產(chǎn)品僅供研究使用,。

 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子）輔助試劑

產(chǎn)品訂購信息

M0198 His-Tag蛋白純化磁珠（鈷離子） IDA-Cobalt  5mL/2×50mL