大鼠丙二醛(MDA)ELISA試劑盒檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預(yù)先包被顆粒酶B（Gzms-B）抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的顆粒酶B（Gzms-B）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度,。
樣品收集,、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測,，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。
自備物品

1. 酶標(biāo)儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL、20-200uL,、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱

操作注意事項

1. 試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶,，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶溶解后再使用,。
2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存。
3. 濃度為0的S0號標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對照或者空白,；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍,，最終結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。
4. 嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間,、加液量及順序進(jìn)行溫育操作,。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

注：標(biāo)準(zhǔn)品（S0-S5）濃度依次為：0,、1,、2、4,、8,、16 pg/mL
試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。
洗板方法

1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次。
2. 自動洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min,，洗板5次。

操作步驟

1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。
2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；
3. 樣本孔先加待測樣本10μL,，再加40μL,；空白孔不加。
4. 除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6. 每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL,，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中,，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,，按曲線方程計算各樣本濃度值,。
試劑盒性能

1. 準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900,。
2. 靈敏度：檢測濃度小于0.1pg/mL,。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4. 重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%,。
5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存,。
6. 有效期：6個月