臍帶血單個(gè)核細(xì)胞（CB-MNC）是通過密度梯度離心法從新生兒臍帶血中分離得到,。主要包含淋巴細(xì)胞,、單核 細(xì)胞、骨髓細(xì)胞以及一些干 / 祖細(xì)胞,。因其具有免疫原性低,、增殖分化能力強(qiáng)、無致瘤性等優(yōu)勢,，可用于組織修復(fù),、 免疫系統(tǒng)疾病、心血管疾病,、消化系統(tǒng)疾病以及間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用等方面的研究中

細(xì)胞復(fù)蘇說明書

一,、試劑耗材

2 復(fù)蘇培養(yǎng)基（10%滅活FBS的DMEM/RPMI-1640培養(yǎng)基）,；

2 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基

2 移液槍；

2 15ml離心管,；

2 水浴鍋,；

2 75%酒精；

2 離心機(jī),；

2 計(jì)數(shù)儀

二,、細(xì)胞解凍

1、將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋中預(yù)熱,；

2、取15mL離心管加入5-10mL預(yù)熱的培養(yǎng)基置于生物安全柜中備用,；

3,、從干冰/液氮中取出細(xì)胞，將凍存管盡可能多的浸入液面以下（至少凍存液部分全部在液面以下）,，確保管蓋在液面上方,，在37℃水浴鍋中輕柔水平畫圈晃動(dòng)凍存管使其快速融化，直到管內(nèi)只剩小片冰晶,，融化過程中可隨時(shí)觀察融化情況,，大約耗時(shí)120s；

4,、用75%酒精消毒凍存管外部后,，將凍存管拿進(jìn)生物安全柜中使用無菌紙或無菌布擦干管壁，然后開蓋,，將管內(nèi)細(xì)胞懸液輕輕吹打混勻,；

5、將細(xì)胞懸液滴加至已準(zhǔn)備好培養(yǎng)基的15mL離心管中,，吸1mL培養(yǎng)基潤洗一下凍存管,，然后蓋上蓋子顛倒混勻；

6,、室溫下,，以300g的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至另一個(gè)干凈的離心管中,，以防離心后細(xì)胞數(shù)量發(fā)生較大偏差,；

7、加入2mL實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸,，然后定容至5mL,混勻準(zhǔn)備計(jì)數(shù),；

8、取10uL細(xì)胞懸液,，按1:1混合AO/PI后使用計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)或使用臺(tái)盼藍(lán)染色然后使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),，記錄細(xì)胞活率和細(xì)胞密度,；

9、下面提供血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)辦法：

N =血球計(jì)數(shù)板的4角大方框所數(shù)的所有細(xì)胞個(gè)數(shù)

d =稀釋倍數(shù)

細(xì)胞數(shù)量/管=N÷4×2×d ×    mL=     × 10⁴

細(xì)胞活率=未被臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞個(gè)數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×1OO%=    %

10,、計(jì)數(shù)之后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求,，添加實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基調(diào)整您需要的細(xì)胞密度進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)。

三,、備注

1,、若您需要再次洗滌細(xì)胞，重復(fù)步驟6-8,，每次洗滌會(huì)造成10-15%的細(xì)胞損失,；

2、若離心后細(xì)胞數(shù)量低于預(yù)期,，將步驟6的上清液再次離心,，可使用400g/10min離心條件離心后重懸計(jì)數(shù)；