一,、細(xì)胞基本屬性：

O

包被條件： PLL(0.1mg/ml)，明膠(0.1%)

培養(yǎng)基：含F(xiàn)BS,、生長(zhǎng)添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

傳代比例：1:2

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%,；CO2，5%

原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二,、在超凈工作臺(tái)中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦,。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì)。

五,、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶,，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六,、室溫1 000×g離心8min，去上清液,。

七,、沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻,，1 000×g,，20min，4℃離心,，去上清,。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶,，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h,，700×g室溫離心6min，去上清液,。

九,、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min,，4℃)，1000×g,，4℃離心10min,。

十、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM

漂洗兩次(離心1000×rpm,，6min，室溫),，去上清液,。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液,。

原代細(xì)胞使用方法：

是一種貼壁細(xì)胞,，細(xì)胞形態(tài)呈內(nèi)皮細(xì)胞樣，在技術(shù)部標(biāo)準(zhǔn)操作流程下,，細(xì)胞可傳2-3代,；建議您收到細(xì)胞后盡快進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

客戶收到細(xì)胞后,，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶,，用75%酒精消毒瓶身,，拆下封口膜，放入37℃,、5%CO2,、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),。

2. 貼壁細(xì)胞消化

1)吸出T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培養(yǎng)瓶中,，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶至消化液覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底后,，吸出多余消化液，37℃溫浴1-3min,；倒置顯微鏡下觀察,，待細(xì)胞回縮變圓后，再加入5ml培養(yǎng)基終止消化,；

3)用吸管輕輕吹打混勻,，按傳代比例接種T25培養(yǎng)瓶傳代，然后補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基至5mL,，置于37℃,、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),；

4)待細(xì)胞貼壁后,，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基,。

3. 細(xì)胞收貨脫落

1)收集所有細(xì)胞懸液,，1000rpm，離心5min,，保留沉淀,；

2)添加0.25%消化液0.5mL至離心管中，重懸沉淀,，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱靜置5-7min),；消化完向離心管內(nèi)加入5ml培養(yǎng)基終止消化,；

3)經(jīng)1000rpm，離心5min,，丟棄上清,，用5ml培養(yǎng)基重懸沉淀，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),；

4)待細(xì)胞貼壁后,，培養(yǎng)觀察；之后按照換液頻率更換新鮮的培養(yǎng)基(37℃預(yù)熱),。

5)原瓶?jī)?nèi)貼壁細(xì)胞按正常消化處理,。

4. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

因原代細(xì)胞貼壁特殊性，貼壁的原代細(xì)胞在消化后轉(zhuǎn)移至其他實(shí)驗(yàn)器皿（如玻璃爬片,、培養(yǎng)板,、共聚焦培養(yǎng)皿等）時(shí)，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)器皿進(jìn)行包被,，以增強(qiáng)細(xì)胞貼壁性,，避免細(xì)胞因沒貼好影響實(shí)驗(yàn)；包被條件常選用鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2） ,，多聚賴氨酸PLL（0.1mg/ml）,，明膠（0.1%），依據(jù)細(xì)胞種類而定,。懸浮/半懸浮細(xì)胞無需包被,。

公司正在出售的產(chǎn)品：

人II型肺泡上皮細(xì)胞Acinetobacter portensis

人氣管上皮細(xì)胞AGL1(pSoup)Chemically Competent Cell

人氣管平滑肌細(xì)胞AGL1農(nóng)桿菌

人支氣管上皮細(xì)胞AH109 酵母菌

人支氣管平滑肌細(xì)胞Alistipes indistinctus

人肺成纖維細(xì)胞Alistipes senegalensis

人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Anaerostipes hadrus

人肺動(dòng)脈高壓血管內(nèi)皮細(xì)胞Apibacter raozihei

人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Arthrographis kalrae

人肺癌細(xì)胞Aspergillus udagawae

人肺微血管周細(xì)胞B646L gene in pet-20b(+)大腸桿菌

人肺腺癌成纖維細(xì)胞B834(DE3) 大腸桿菌

人心肌細(xì)胞BJ5183 Chemically Competent Cell

人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞BJ5183-AD-1 Chemically Competent Cell

人心肌成纖維細(xì)胞BL21 Chemically Competent Cell

人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞BL21 CodonPlus (DE3)-RIPL大腸表達(dá)菌

人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞BL21 Star(DE3) 大腸桿菌

人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞BL21(AI) 大腸桿菌

人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-E-protein質(zhì)粒）大腸桿菌

人頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-Helicase質(zhì)粒）大腸桿菌

人頸動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP10質(zhì)粒）大腸桿菌

人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP16質(zhì)粒）大腸桿菌

人頸靜脈球瘤細(xì)胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP1質(zhì)粒）大腸桿菌

人動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP2質(zhì)粒）大腸桿菌

人肝動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP6質(zhì)粒）大腸桿菌

人肝動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP7質(zhì)粒）大腸桿菌

人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞人腔靜脈平滑肌細(xì)胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-NSP8質(zhì)粒）大腸桿菌

人腔靜脈外膜成纖維細(xì)胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-ORF10質(zhì)粒）大腸桿菌

人主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-ORF3A質(zhì)粒）大腸桿菌

人食管上皮細(xì)胞BL21(DE3)（含pET-32a(+)-ORF6質(zhì)粒）大腸桿菌