mRNA RT-qPCR檢測

定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是應(yīng)用于以RNA作為起始材料的PCR實驗中的一種實 驗方法。在該方法中,，總RNA或信使RNA（mRNA）首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補DNA（cDNA）,。隨后，以cDNA為模板 進行qPCR反應(yīng),。RT-qPCR已被用于多種分子生物學(xué)的應(yīng)用中，其中包括基因表達(dá)分析,、RNA干擾驗證,、微陣列驗證、病原 體檢測,、基因測試和疾病研究。

RT-qPCR的一步法與兩步法 RT-qPCR可通過一步法或兩步法來完成

（圖1、表1）,。一步法RT-qPCR把逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴增結(jié)合在一起,，使逆轉(zhuǎn)錄酶與 DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng),。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物,。在兩步法RT-qPCR中,， 逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增過程是在兩個管中完成,，使用不同的優(yōu)化的緩沖液,、反應(yīng)條件,、以及引物設(shè)計策略,。

圖 1.一步法與兩步法RT-qPCR

表 1.一步法及兩步法RT-qPCR優(yōu)缺點比較

RT-qPCR逆轉(zhuǎn)錄過程

總RNA與mRNA的選擇

在設(shè)計RT-qPCR實驗過程中,，決定是否要使用總RNA或純化的mRNA作為模板進行逆轉(zhuǎn)錄十分重要,。盡管mRNA可能能夠 提供略高的靈敏度,，但總RNA仍經(jīng)常使用,。其原因是總RNA作為起始材料具有較mRNA更重要的優(yōu)勢,。首先,，其過程需要較 少的純化步驟,，這確保了更好的定量回收模板和更好的把結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為起始的細(xì)胞數(shù),。其次,，其避免了mRNA富集步驟，這 能夠避免由于不同mRNA的回收率不同而帶來的結(jié)果偏移的可能性,?？偟膩碚f,，由于在大多數(shù)的應(yīng)用中,，目標(biāo)基因的相對定 量比檢測的絕dui靈敏度更為重要,，因此在大多數(shù)情況下，總RNA更適用1,。

逆轉(zhuǎn)錄引物

在兩步法中,，有三種不同的方法可用于引發(fā)cDNA反應(yīng)：oligo(dT) 引物、隨機引物,、或序列特異性引物（圖2,，表2）。通常 情況下,，是將 oligo(dT) 引物和隨機引物進行混合使用,。這些引物退火至模板 mRNA 鏈，并提供給逆轉(zhuǎn)錄酶一個用于合成的起點位置,。

圖 2.兩步法 RT-qPCR 中四種逆轉(zhuǎn)錄引發(fā)方法,。

表 2.RT-qPCR 的 cDNA 合成中的引物注意事項。結(jié)合使用隨機引物與錨定 oligo(dT) 引物可提高逆轉(zhuǎn)錄效率及 qPCR 的靈 敏度,。

逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶 是利用 RNA 合成 DNA 的一種酶,。一部分逆轉(zhuǎn)錄酶具有 RNA 酶活性，能夠在轉(zhuǎn)錄后降解 RNA-DNA 雜交鏈中的 RNA 鏈,。如果其不具有 Rnase 酶活性,，可加入 RNaseH 以獲得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆 轉(zhuǎn)錄酶和禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶,。對于 RT-qPCR 來說,，理想的情況下是選擇具有較高熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶,，這樣 cDNA 的合成能夠在較高的溫度下進行，確保成功轉(zhuǎn)錄具有較高二級結(jié)構(gòu)的 RNA,，同時保持其在整個反應(yīng)過程中的全部活 性,，從而得到更高的 cDNA 產(chǎn)量。

逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNase H 活性

RNase H 能夠從 RNA-DNA 雙鏈中降解 RNA 鏈,，從而允許雙鏈 DNA 的有效合成,。然而，當(dāng)使用長 mRNA 作為模板,， RNA 可能被過早的降解,，從而導(dǎo)致截短的 cDNA。因此,，在 cDNA 克隆過程中,，如果需要合成長的轉(zhuǎn)錄物時，盡量減小 RNase H 的活性通常是有益的,。與此相反,，擁有 RNase H 活性的逆轉(zhuǎn)錄酶通常有利于 qPCR 的應(yīng)用，因為它們能夠在 PCR 的第yi個循環(huán)中提高 RNA-DNA 雙鏈的熔解（圖3）,。

圖 3.逆轉(zhuǎn)錄酶中 RNase H 活性

在 qPCR 中,，使用具有 RNA 酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶。

RT-qPCR 的 qPCR 過程

引物設(shè)計

用于 RT-qPCR 中 qPCR 步驟的 PCR 引物好的應(yīng)設(shè)計成跨越一個外顯子-外顯子連接,，其中一條擴增引物可以潛在地跨越實 際外顯子-內(nèi)含子邊界（圖4）,。由于含內(nèi)含子的基因組 DNA 序列不會被擴增，因此這種設(shè)計可以減少從污染的基因組DNA 中擴增得到的假陽性的風(fēng)險,。 如果引物不能被設(shè)計成能夠分離外顯子或外顯子-外顯子邊界,，則有必要利用無 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶處理 RNA 樣品以除去基因組 DNA 污染。 RT-qPCR 對照 一個逆轉(zhuǎn)錄陰性對照（-RT對照）應(yīng)該包括在所有的 RT-qPCR 的實驗中,，以檢測 DNA 污染（如基因組 DNA 或來自之前反 應(yīng)的 PCR 產(chǎn)物）,。這一對照包含除逆轉(zhuǎn)錄酶之外的所有反應(yīng)組分。由于該對照不會發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄,，因此如果觀察到 PCR 擴 增,，則極有可能來自 DNA 的污染。

圖 4.RT-qPCR 中 qPCR 步驟的引物設(shè)計

1）如果一個引物被設(shè)計為跨越外顯子-內(nèi)含子邊界,，則可能造成污染的基因組 DNA 將不會被擴增,，其原因是引物不能退火至該基因組 DNA 模板。相反,，cDNA 不含任何內(nèi)含子,，能夠有效被引物識別并 擴增。

2）當(dāng)引物側(cè)接一個長的內(nèi)含子（例如1 kb）,，擴增反應(yīng)將不會發(fā)生,，因為短的延伸時間僅夠用于擴增短的 cDNA,， 卻不足以擴增基因組靶基因。

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