OmniFluo-FLIM系列 顯微熒光光譜儀
- 公司名稱 上海激譜光電有限公司
- 品牌 其他品牌
- 型號 OmniFluo-FLIM系列
- 產(chǎn)地
- 廠商性質(zhì) 經(jīng)銷商
- 更新時(shí)間 2025/1/22 20:50:12
- 訪問次數(shù) 1491
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| ?系統(tǒng)性能指標(biāo) | 見下方 | 光譜掃描范圍 | 200-900nm |
|---|---|---|---|
| *小時(shí)間分辨率 | 16ps | 熒光壽命測量范圍 | 500ps-1μs@?皮秒脈沖激光器 |
| 空間分辨率 | ≤1μm@100X?物鏡@405nm?皮秒脈沖激光器 | 熒光壽命檢測IRF | ≤2ns |
產(chǎn)品概述:
OmniFluo-FLIM系列顯微熒光光譜儀由科研級正置顯微鏡,，配合多波長光路轉(zhuǎn)換機(jī)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)一套系統(tǒng)多波長激發(fā)的靈活應(yīng)用,，適應(yīng)不同樣品測試需求,。
高精度平移臺對樣品做微米量級的步進(jìn)控制，實(shí)現(xiàn)空間高分辨率掃描,。樣品發(fā)光有高效收光光路,，由高速、高靈敏探測器接收,，再由時(shí)間分辨精度達(dá)到16ps的時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器來獲得樣品的熒光壽命,。集成軟件自動擬合個(gè)采集點(diǎn)熒光壽命，最終得到樣品的壽命影像,。
一,、熒光和熒光壽命
分子包含多個(gè)單能態(tài)S0、S1,、S2…和三重態(tài)T1…,，每個(gè)能態(tài)都包含多個(gè)精細(xì)的能級,。正常情況下,，大部分電子處在*低能態(tài)即基態(tài)S0 的*低能級上，當(dāng)分子被光束照射,，會吸收光子能量,，電子被激發(fā)到更高的能態(tài)S1 或S2 上，在S2 能態(tài)上的電子只能存在很短暫的時(shí)間,，便會通過內(nèi)轉(zhuǎn)換過程躍遷到S1 上,，而S1 能態(tài)上的電子亦會在極短時(shí)間內(nèi)躍遷到S1 的*低能級上,，而這些電子會存在一段時(shí)間后通過震蕩弛豫輻射躍遷到基態(tài)，這個(gè)過程會釋放一個(gè)光子,，即熒光,。此外亦會有電子躍遷至三重態(tài)T1 上，再由T1 躍遷至基態(tài),，我們稱之為磷光,。
二、顯微熒光光譜儀熒光特性:
研究熒光特性時(shí),，主要在以下幾方面進(jìn)行分析：激發(fā)光譜，發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度,、偏振熒光,、熒光發(fā)光量子產(chǎn)率、熒光壽命等,。其中熒光壽命（Fluorescence Lifetime）是指熒光分子在激發(fā)態(tài)上存在的平均時(shí)間（納秒量級）,。
熒光壽命測試
熒光壽命一般在幾納秒至幾百納秒之間，如今主要有兩類測試方法：時(shí)域測量和頻域測量時(shí)間穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測試曲線：
1,、時(shí)域測量
由一束窄脈沖將熒光分子激發(fā)至較高能態(tài)S1,，接著測量熒光的發(fā)射幾率隨時(shí)間的變化。其中目前廣泛應(yīng)用的是時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù),，即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting),。
時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC) 實(shí)現(xiàn)了從百ps-ns-us 的瞬態(tài)測試，此方法對數(shù)據(jù)的獲取依賴快速探測器和高速電路,。用統(tǒng)計(jì)的方法計(jì)算樣品受激后發(fā)出的*一個(gè)光子與激發(fā)光之間的時(shí)間差,，也就是下圖的START( 激發(fā)時(shí)刻) 與STOP( 發(fā)光時(shí)刻) 的時(shí)間差。由于對于Stop 信號的要求,，所以TCSPC 一般需要高重復(fù)頻率的光源作為激發(fā)源,，其重復(fù)至少要在100KHz 以上，多數(shù)的光源都會達(dá)到MHz 量級,；同時(shí),，在一般情況下還要對Stop 信號做數(shù)量上的控制，做到盡量滿足在一個(gè)激發(fā)周期內(nèi),，樣品產(chǎn)生且只產(chǎn)生一個(gè)光子的有效熒光信號,，避免光子對的出現(xiàn)。
2,、頻域測量
對連續(xù)激發(fā)光進(jìn)行振幅調(diào)制后,，分子發(fā)出的熒光強(qiáng)度也會受到振幅調(diào)制，兩個(gè)調(diào)制信號之間存在與熒光壽命相關(guān)的相位差,，因此可以測量該相位差計(jì)算熒光壽命,。
左圖為正弦調(diào)制激發(fā)光（綠色）頻域顯示,，發(fā)射光信號（紅色）相應(yīng)的相位變化頻域顯示。
右圖為對應(yīng)不同壽命的調(diào)制和相位的頻域顯示,。TM- 調(diào)制壽命,，TP- 相位壽命。
顯微熒光壽命成像技術(shù)（FLIM）,。
顯微熒光壽命成像技術(shù)（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy,，F(xiàn)LIM）是一種在顯微尺度下展現(xiàn)熒光壽命空間分布的技術(shù)，由于其不受樣品濃度影響,，具有其他熒光成像技術(shù)無法代替的優(yōu)異性能,，目前在生物醫(yī)學(xué)工程、光電半導(dǎo)體材料等領(lǐng)域是一種重要的表征測量手段,。
FLIM 一般分為寬場FLIM 和激光掃描FLIM,。
寬場FLIM（Wide Field FLIM,WFM）
該技術(shù)是用平行光照明并由物鏡聚焦樣品獲得熒光信號，再由一寬場相機(jī)采集熒光成像,。寬場FLIM 常用于快速獲取大面積樣品成像,。時(shí)域或是頻域壽命采集都可以應(yīng)用在寬場成像FLIM 上。寬場FLIM 有更高幀率和低損傷的優(yōu)勢,。
2 激光掃描FLIM（Laser Scanning FLIM,LSM）
激光掃描FLIM 是針對選定區(qū)域內(nèi)的樣品逐點(diǎn)獲取其熒光衰減曲線,，再經(jīng)過擬合*終合成熒光壽命圖像。相比寬場FLIM,，其在空間分辨率,、信噪比方面有更大的優(yōu)勢。掃描方式有兩種：一種是固定樣品,，移動激光進(jìn)行掃描,，一種是固定激光，電動位移臺帶動樣品移動進(jìn)行掃描,。
三,、FLIM 應(yīng)用
（1）寬禁帶半導(dǎo)體如GaN,、SiC 等體系的少子壽命mapping 測量
（2）量子點(diǎn)如CdSe@ZnS 等用作熒光壽命成像顯微鏡探針
（3）鈣鈦礦電池/LED 薄膜的組分分析,、缺陷檢測
（4）銅銦鎵硒CIGS，銅鋅錫硫CZTS 薄膜太陽能電池的組分,、缺陷檢測
（5）鑭系上轉(zhuǎn)換納米顆粒
（6）GaAs 或GaAsP 量子阱的載流子擴(kuò)散研究
2,、生命科學(xué)領(lǐng)域
（1）細(xì)胞體自身熒光壽命分析
（2）自身熒光相對熒光標(biāo)記的有效區(qū)分
（3）活細(xì)胞內(nèi)水介質(zhì)的PH 值測量
（4）局部氧氣濃度測量
（5）具有相同頻譜性質(zhì)的不同熒光標(biāo)記的區(qū)分
（6）活細(xì)胞內(nèi)鈣濃度測量
（7）時(shí)間分辨共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：納米級尺度上的遠(yuǎn)差測量，環(huán)境敏感的FRET 探針定量測量
（8）代謝成像：NAD(P)H 和FAD 胞質(zhì)體的熒光壽命成像
四,、OmniFluo-FLIM系列顯微熒光壽命成像系統(tǒng)應(yīng)用案例
1,、用熒光分子對海拉細(xì)胞進(jìn)行染色
用熒光分子轉(zhuǎn)子Bodipy-C12 對海拉細(xì)胞（宮頸癌細(xì)胞的一種） 進(jìn)行染色：
(a) 顯微熒光壽命成像圖,，壽命范圍1ns（藍(lán)色）到2.5ns（紅色）,；
(b) 熒光壽命直方圖,，脂肪滴的短壽命約在1.6ns 附近，細(xì)胞中其他位置壽命較長,，在1.8ns 附近,；
用熒光分子轉(zhuǎn)子的時(shí)間分辨測量*大的好處在于熒光壽命具備足夠清晰的標(biāo)簽特性，且與熒光團(tuán)的濃度無關(guān),。
2,、金屬修飾熒光
金屬修飾熒光：
(a) 熒光壽命是熒光團(tuán)到金表面距離的函數(shù)；
(b) 用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記乳腺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜的共聚焦xz 橫截面,，垂直比例尺：5m,；
(c) b 圖的FLIM 圖，金表面附近的GFP 熒光壽命縮短,。
3,、鈣鈦礦太陽能電池
下圖研究中，展示了一種動態(tài)熱風(fēng)（DHA）制備工藝來控制全無機(jī)PSC 的薄膜形態(tài)和穩(wěn)定性,，該工藝不含有常規(guī)的有害反溶劑,，可以在大氣環(huán)境中制備。同時(shí),，鈣鈦礦摻有鋇（Ba2+） 堿金屬離子（BaI2:CsPbI2Br）,。這種DHA 方法有助于形成均勻的晶粒并控制結(jié)晶，從而形成穩(wěn)定的全無機(jī)PSC,。從而在環(huán)境條件下形成完整的黑色相,。經(jīng)過DHA處理的鈣鈦礦光伏器件，在0.09cm小面積下,，效率為14.85%,，在1x1cm的大面積下，具有13.78%的*高效率,。DHA方法制備的器件在300h后仍然保持初始效率的92%,。
4 MQWs 多量子阱研究
在(a) 藍(lán)寶石和(b) GaN 上生長的MQWs 的共焦PL mapping 圖像。具有較小尺寸的發(fā)光團(tuán)的*高密度是觀察到在GaN 上生長的MQWs,。在(c) 藍(lán)寶石和(d)GaN 上生長的MQWs 的共焦TRPL mapping 圖,。僅對于在GaN 上生長的MQWs，強(qiáng)的PL 強(qiáng)度區(qū)域與較長PL 衰減時(shí)間的區(qū)域很好地匹配,。在(e) 藍(lán)寶石和(f)GaN 上生長的MQWs 在A 點(diǎn)和B 點(diǎn)測量的局部PL 衰減曲線,，均標(biāo)記在圖中。對于在GaN 上生長的MQWs,，點(diǎn)A 和B 之間的PL 衰減時(shí)間差更高,。
五、OmniFluo-FLIM系列顯微熒光壽命成像系統(tǒng)參數(shù)配置
提供的顯微熒光壽命成像系統(tǒng)是基于顯微和時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)，配合高精度位移臺得到微觀樣品表面各空間分布點(diǎn)的熒光衰減曲線,，再經(jīng)過用數(shù)據(jù)擬合,，得到樣品表面發(fā)光壽命表征的影像。是光電半導(dǎo)體材料,、熒光標(biāo)記常用熒光分子等類似熒光壽命大多分布在納秒,、幾十、幾百納秒尺度的物質(zhì)的常用選擇,。
參數(shù)指標(biāo)：
| 系統(tǒng)性能指標(biāo) | |
| 光譜掃描范圍 | 200-900nm |
| *小時(shí)間分辨率 | 16ps |
| 熒光壽命測量范圍 | 500ps-1μs@ 皮秒脈沖激光器 |
| 空間分辨率 | ≤1μm@100X 物鏡@405nm 皮秒脈沖激光器 |
| 熒光壽命檢測IRF | ≤2ns |
| 配置參數(shù) | |
| 激發(fā)源及匹配光譜范圍 （光源參數(shù)基于 50MHz 重復(fù)頻率） | 375nm 皮秒脈沖激光器,，脈寬：30ps，平均功率1.5mW,，熒光波段：400-850nm |
| 405nm 皮秒脈沖激光器,，脈寬：25ps，平均功率2.5mW,，熒光波段：430-920nm | |
| 450nm 皮秒脈沖激光器,，脈寬：50ps，平均功率1.9mW,，熒光波段：485-950nm | |
| 488nm 皮秒脈沖激光器,，脈寬：70ps,，平均功率1.3mW,，熒光波段：500-950nm | |
| 510nm 皮秒脈沖激光器，脈寬：75ps,，平均功率1.1mW,，熒光波段：535-950nm | |
| 635nm 皮秒脈沖激光器,，脈寬：65ps，平均功率4.3mW,，熒光波段：670-950nm | |
| 660nm 皮秒脈沖激光器,，脈寬：60ps,，平均功率1.9mW,，熒光波段：690-950nm | |
| 670nm 皮秒脈沖激光器,，脈寬：40ps，平均功率0.8mW,，熒光波段：700-950nm | |
| 科研級正置顯微鏡 | 落射明暗場鹵素?zé)粽彰鳎?2V，100W 5 孔物鏡轉(zhuǎn)盤，標(biāo)配明場用物鏡：10×,，50×,，100× 監(jiān)視CCD：高清彩色CMOS 攝像頭,，像元尺寸：3.6μm*3.6μm,， 有效像素：1280H*1024V,，掃描方式：逐行，快門方式：電子快門 |
| 電動位移臺 | 高精度電動XY 樣品臺,，行程：75*50mm（120*80mm 可選）， *小步進(jìn)：50nm,，重復(fù)定位精度：＜ 1μm |
| 光譜儀 | 320mm 焦距影像校正單色儀,，雙入口、狹縫出口,、CCD 出口,， 配置三塊68×68mm 大面積光柵，波長準(zhǔn)確度：±0.1nm,， 波長重復(fù)性：±0.01nm,，掃描步距：0.0025nm，焦面尺寸：30mm(w)×14mm(h),， 狹縫縫寬：0.01-3mm 連續(xù)電動可調(diào) |
| 探測器：制冷型紫外可見光電倍增管,，光譜范圍：185-900nm（標(biāo)配，可擴(kuò)展） | |
| 光譜CCD （可擴(kuò)展PLmapping） | 低噪音科學(xué)級光譜CCD（LDC-DD）,，芯片格式：2000x256,， 像元尺寸：15μm*15μ m, 探測面：30mm*3.8mm，背照式深耗盡芯片,， 低暗電流，*低制冷溫度-60℃ @25℃環(huán)境溫度,，風(fēng)冷,，*高量子效率值>95% |
| 時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器（TCSPC） | 時(shí)間分辨率：16/32/64/128/256/512/1024ps……33.55μs，死時(shí)間＜ 10ns,， *高65535 個(gè)直方圖時(shí)間窗口,，瞬時(shí)飽和計(jì)數(shù)率：100Mcps，支持穩(wěn)態(tài)光譜測試,； |
| OmniFluo-FM 熒光壽命成像專用軟件 | 控制功能：控制樣品平移臺移動，通過顯微鏡的明場光學(xué)像定位到合適區(qū)域,， 框選掃描區(qū)域進(jìn)行掃描，逐點(diǎn)獲得熒光衰減曲線,，實(shí)時(shí)生成熒光圖像等 數(shù)據(jù)處理功能：自動對掃描獲得的FLIM 數(shù)據(jù),，逐點(diǎn)進(jìn)行多組分熒光壽命擬合 （組分?jǐn)?shù)小于等于4），對逐點(diǎn)擬合獲得的熒光強(qiáng)度,、熒光壽命等信息生成 偽彩色圖像顯示 圖像處理功能：直方圖、色表,、等高線,、截線分析,、3D 顯示等 |
| 操作電腦 | 品牌操作電腦，Windows 10 操作系統(tǒng) |
FLIM 軟件界面
控制測試界面
測試軟件的界面遵循“All In One”的簡潔設(shè)計(jì)思路，用戶可在下圖所示的控制界面中完成采集數(shù)據(jù)的所有步驟：包括控制樣品平移臺移動,，通過顯微鏡的明場光學(xué)像定位到合適區(qū)域,，框選掃描區(qū)域進(jìn)行掃描,，逐點(diǎn)獲得熒光衰減曲線,，實(shí)時(shí)生成熒光圖像等,。
數(shù)據(jù)處理界面
功能豐富的熒光壽命數(shù)據(jù)處理軟件,，充分挖掘用戶數(shù)據(jù)中的寶貴信息,?？勺詣訉呙璜@得的FLIM 數(shù)據(jù),，逐點(diǎn)進(jìn)行多組分熒光壽命擬合（組分?jǐn)?shù)小于等于4）,，對逐點(diǎn)擬合獲得的熒光強(qiáng)度、熒光壽命等信息生成偽彩色圖像顯示,。
自主開發(fā)的一套時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）熒光壽命的擬合算法,，可對熒光衰減曲線中*多包含4 個(gè)時(shí)間組分的熒光過程進(jìn)行擬合,，獲得每個(gè)組分的熒光壽命,，光子數(shù)比例,，計(jì)算評價(jià)函數(shù)和殘差,。TCSPC 熒光壽命通常并非簡單的指數(shù)衰減過程,，而是與光源及探測器相關(guān)的儀器響應(yīng)函數(shù)（IRF）與熒光衰減過程相互卷積的結(jié)果,，因此適當(dāng)?shù)臄M合方法和參數(shù)選擇對獲得正確可靠的熒光壽命非常重要,。該軟件可導(dǎo)入實(shí)際測量的IRF 對衰減曲線進(jìn)行卷積計(jì)算和擬合,。但是大多數(shù)情況下,， IRF 很難正確的從實(shí)驗(yàn)獲得,，針對這種情況,，軟件提供了兩種無需實(shí)驗(yàn)獲取IRF 的擬合方法：
方法一： 通過算法對數(shù)據(jù)上升沿進(jìn)行擬合，獲得時(shí)間響應(yīng)函數(shù)IRF,，然后對整條衰減曲線進(jìn)行卷積計(jì)算和擬合得到熒光壽命,。
方法貳：對于衰減時(shí)間遠(yuǎn)長于儀器響應(yīng)時(shí)間的，可對衰減曲線下降沿進(jìn)行直接的指數(shù)擬合,。該軟件經(jīng)過大量測試,，可以很好的滿足各種場合的用戶需求。
MicroLED 微盤的熒光強(qiáng)度像（3D 顯示）：
六,、測試案例
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