1. 技術(shù)簡介
實時熒光定量PCR(real-time quantitativePCR),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR或熒光標(biāo)記的特異性探針,,利用熒光信號的積累實時在線監(jiān)控PCR反應(yīng)過程,由于在PCR擴增基因的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,,所以成為定量的依據(jù),,可以實現(xiàn)對目的基因在樣本中的定量。
熒光定量PCR不僅實現(xiàn)真正實現(xiàn)了定量,,而且具有靈敏度和特異性、高能實現(xiàn)多重反應(yīng),、自動化程度高,、無污染、實時和準(zhǔn)確等特點,。隨著生物芯片技術(shù)和熒光探針定量技術(shù)的結(jié)合,,實時熒光定量PCR在醫(yī)學(xué)檢測及其他各個領(lǐng)域中的應(yīng)用前景十分廣闊。
2. 方法介紹
根據(jù)Real-time qPCR所使用熒光化學(xué)物質(zhì)有熒光染料和熒光探針兩類,,根據(jù)使用熒光物質(zhì)不同,,該技術(shù)常用的方法有SYBR Green染料法和TaqMan探針法。
2.1 SYBR Green染料法
目前主要使用的熒光染料分子是SYBR Green I,,SYBR Green I是一種能與DNA雙鏈小溝的特異性結(jié)合染料,。游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號,而結(jié)合雙鏈DNA后,,則會發(fā)射熒光信號,。在熒光定量PCR擴增過程中,隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增,,PCR產(chǎn) 物不斷積累,,熒光信號也會相應(yīng)的增加,其熒光信號強度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量,。SYBR Green I方法是一種最基礎(chǔ)也常用的Real-time qPCR實驗手段,。
熒光染料的優(yōu)點:使用簡便;可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合,;價格便宜
2.2 TaqMan探針法
Real-time qPCR中常用的熒光探針為TaqMan探針,,根據(jù)目的基因設(shè)計合成特異性的探針,該探針的5'端標(biāo)記熒光基團,3'端標(biāo)記淬滅基團,。
正常情況下兩個基團的空間距離很近,,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。當(dāng)擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,,Taq酶利用5'外切酶活性,,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光,。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量,。
TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點:
熒光背景低,;
敏感性高;
穩(wěn)定性高,;
特異性高,。
3. 操作方法
(1)根據(jù)目的基因序列分別設(shè)計特異性的引物或者熒光探針;
(2)提取各樣本DNA/RNA,、RNA反轉(zhuǎn)錄,、跑電泳、測濃度,;
(3)去基因組DNA,,RNA反轉(zhuǎn)錄;
(4)配置PCR反應(yīng)體系,,加入模板,、引物、染料和dNTP等體系所需的溶液,;
(5) RealTime PCR(熒光定量PCR)擴增,,
(6)拿到下機數(shù)據(jù),進行擴增曲線,、溶解曲線,、表達量差異等分析。