儀器概況

       光譜儀（spectrometer）和分光光度計（Spectrophotometer）,是將成分復(fù)雜的光分解為光譜線的科學(xué)儀器,。

       當(dāng)光線通過某種物質(zhì)的溶液時透過的光的強(qiáng)度減弱,，因為有一部分光在溶液的表面反射或分散,，一部分光 被組成此溶液的物質(zhì)所吸收，只有一部分光可透過溶液,。因此：

入射光=反射光+分散光+吸收光+透過光,。

如果我們用蒸餡水（或組成此溶液的溶劑）作為“空白”去校正反射，分散等因素造成的入射光的損失,，則 出現(xiàn)：

入射光=吸收光十透過光,。

        不同的光源都有其發(fā)射光譜，因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源,。不同物質(zhì)都有特定的吸收光譜,，根據(jù)溶液的吸收光譜，可以鑒別溶液中所含的物質(zhì)成分,。

        鈣燈發(fā)射光譜：鴇燈光源所發(fā)出380?780nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后,，可得到由紅、橙,、黃,、綠、 藍(lán),、靛,、紫組成的連續(xù)色譜，該色譜可作為可見光分光光度計的光源,。

        氫燈（或笊燈）發(fā)射光譜：氫燈（或気燈）能發(fā)出185-400nm波長的光譜,，可作為紫外光光度計的光源。

常用的波長范圍包括：

（1）     200?380nm的紫外光區(qū),；

（2）     380~780nm的可見光區(qū),；

（3）     2.5?25卩m （按波數(shù)計為4000/®米?400/厘米）的紅外光區(qū)。

       用于測量200?380nm的紫外光區(qū)物質(zhì)吸光度的儀器為紫外分光光度計,；

       用于測量380?780nm的可見光區(qū)物質(zhì)吸光度的儀器為可見光分光光度計（或比色計）：

       用于測量2.5?25〃 m （按波數(shù)計為4000/厘米?400/厘米）的紅外光區(qū)物質(zhì)吸光度的儀器為紅外分光光度計 或原子吸收分光光度計,。

工作原理

       光譜儀和分光光度計釆用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置,，從而產(chǎn)生特定波長的光源， 光線透過測試的樣品后,，部分光線被吸收,，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品 的濃度成正比,。

       單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液吋，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比,， 其關(guān)系如下式：

A=-lg（I/Io）=-lgT=kLc

式中：A為吸光度：Io為入射的單色光強(qiáng)度,；1為透射的單色光強(qiáng)度：T為物質(zhì)的透射率,；k為摩爾吸收系數(shù); L為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長,；c為物質(zhì)的濃度,；

儀器用途

1.    核酸的定量

       核酸定量是紫外光譜儀和紫外分光光度計使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核昔酸,，單鏈、 雙鏈DNA,以及RNA,。核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm,。

        除了核酸濃度，光譜儀和分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,，如A260/A280的比值,， 用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nmo

       純凈的樣品,，比值大于1.8 （DNA）或者2.0 （RNA）,。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類 物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,，多肽，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比 值大于2.0,。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,，A320一般是0,。

2.    蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）

       這種方法是在280nm波長直接測試蛋白，光度計可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應(yīng)的換算方法, 將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液,，然后直接測試蛋白質(zhì),。由于緩沖液中存 在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm的“背景”信息,。

3.    比色法蚩白質(zhì)定量

       蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物,，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸） 與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì),。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反映的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而 反映蛋白質(zhì)濃度,。比色方法一般有BCA,、Bradford,、Lowry等兒種方法。

4.    細(xì)菌細(xì)胞密度（OD 600）

       實驗室確定細(xì)菌生長密度和生長期,，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷細(xì)菌的生長密度,。在遇到要求較高的實驗，需要 釆用分光光度計準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度,。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法,。以未加菌液的培養(yǎng) 液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液,。

5.    海洋學(xué)研究中痕量物質(zhì)濃度

       WPI公司設(shè)計長光程液態(tài)樣本流通池（LWCC）具有50,、100、250和500不同的光程可以選擇,。因此,，不同 光程長度的LWCC配合適的光源和檢測器，常用于海洋學(xué)應(yīng)用中營養(yǎng)物分析的流體注射分析系統(tǒng)（如硝酸鹽,、 亞硝酸鹽,、磷酸鹽和鐵離子檢測等）。海水和淡水中CDOM （有色溶解有機(jī)物含量）的檢測,，因為海水中CDOM的 含量極低（0.007m-l）,。

6.    大氣環(huán)境中超低含量物質(zhì)濃度

      大氣中的SO2、硝酸鹽,、亞硝酸鹽,、羥基、棕碳,、黑碳,、水溶性鐵、氣溶膠等含量很低,，使用普通的分光光 度計很難檢測出來,。將大氣中釆集的樣本液態(tài)化，再配合不同光程的LWCC進(jìn)行檢測,，可以將這些含量極低的 物質(zhì)加以檢出,。