RIPA裂解液（強(qiáng)）

保存條件：-20℃。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液,。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western,、IP等。

RIPA裂解液(強(qiáng))的主要成分為50mM Tris(pH 7.4),，150mM NaCl,，1%的triton ，1% sodium deoxycholate,，0.1% SDS,，以及sodium orthovanadate，EDTA,，leupeptin等多種抑制劑,。可以有效抑制蛋白降解,。

注意事項(xiàng)：     

1,、為取得最佳的使用效果，盡量避免過(guò)多的反復(fù)凍融,?？梢赃m當(dāng)分裝后使用。
2,、需自備PMSF,。
3、裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行,。

使用說(shuō)明：

對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：

1.融解RIPA裂解液,，混勻。取適當(dāng)量的裂解液,，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,，使PMSF的最終濃度為1mM。

2.對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液,，用PBS,、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒(méi)有干擾，可以不洗),。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液,。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸,。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后,，細(xì)胞就會(huì)被裂解。

對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞,，用手指把細(xì)胞用力彈散,。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液,。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉淀,。如果細(xì)胞量較多,，必需分裝成50-100萬(wàn)細(xì)胞/管，然后再裂解,。

3.充分裂解后,，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清,，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE,、Western和免疫沉淀等操作。

裂解液用量說(shuō)明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠,，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升,。

對(duì)于組織樣品：

1. 把組織jan切成細(xì)小的碎片。

2. 融解RIPA裂解液,，混勻,。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,，使PMSF的最終濃度為1mM,。

3. 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液,，如果需要高濃度的蛋白樣品,，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)

4. 用玻璃勻漿器勻漿,，直至充分裂解。

5. 充分裂解后,，10000-14000g離心3-5分鐘,，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE,、Western和免疫沉淀等操作,。

6. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解,，通過(guò)強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分,。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便,，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分,。

注：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物,，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物,。在不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下,，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,，則可以通過(guò)超聲處理打碎打散該透明膠狀物,，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測(cè)一些常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子,，例如NF-kappaB,、p53等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理,，就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子,。

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BCA蛋白定量試劑盒   貨號(hào)B5001