HA-Nanoab-Agarose

貨號：HNA-50-1000

儲存條件：可在4℃保存1年(確保wan全密封)，或在-80℃長期保存,，避免反復(fù)凍融,。

產(chǎn)品描述

wan沒有普通抗體的輕鏈和重鏈，背景干凈,；

即用型,，節(jié)約時間；

高親和力,，高載量,。

應(yīng)用范圍

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）/RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）,、酶活性測定,、質(zhì)譜分析等。

特異性

特異性結(jié)合位于融合蛋白N-端,、C-端及內(nèi)部的HA-tag。

產(chǎn)品特性

存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇),。

保存條件：可在4℃保存1年(確保wan全密封),，或在-80℃長期保存，避免反復(fù)凍融,。

實驗原理

實驗步驟：

收集細胞
每個免疫沉淀反應(yīng)大約使用 10⁶-10⁷ 個表達HA-tag融合蛋白的細胞,，可根據(jù)HA-tag融合蛋白表達量適當調(diào)整細胞數(shù)。吸出培養(yǎng)基,，向培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的1×PBS,，漂洗2次，利用細胞刮或yi酶消化收集貼壁細胞,，細胞轉(zhuǎn)移到離心管,，500g離心3分鐘并丟棄上清液。

植物組織裂解處理

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中,，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨,，盡 可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進行裂解,，為了提高裂解效率,，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成后 12000rpm,，離心 30min,，吸取上清 置新的離心管中,，棄去沉淀。

細胞裂解

1．在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑,，用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液重懸細胞,。

2．置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次,。

3．4℃,，20,000g離心15分鐘，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個新的預(yù)冷管中,，丟棄沉淀,。注意：此時細胞裂解產(chǎn)物可長期保存于-80℃。

結(jié)合蛋白
4．將平衡好的HA-Nanoab-Agarose加入到細胞裂解產(chǎn)物中（可在細胞裂解產(chǎn)物中直接加入20μl該產(chǎn)品）,，于4℃旋轉(zhuǎn)混合結(jié)合1小時,。根據(jù)實驗需要可調(diào)整結(jié)合時間。如果需要,，留存50μl的裂解產(chǎn)物進行免疫印跡分析,。
5．4℃，2,500g離心30秒,，丟棄上清液,。如果需要，留存50μl上清液進行免疫印跡分析,。

清洗珠子
6．用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液中重懸5中的HA-Nanoab-Agarose,，4℃，2,500g條件下離心30秒,，丟棄上清液并重復(fù)清洗3次,。盡量減少清洗時間。

洗脫蛋白
方法一：
7．加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸HA-Nanoab-Agarose,。95℃,，加熱10min充分變性，2,500g離心30秒收集上清,，收集的產(chǎn)物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析,。
方法二：
8．加入50μl 0.2 M pH2.5的gan氨酸洗脫結(jié)合的蛋白，孵育時間30秒,，期間不斷混勻,，2,500g離心30秒收集上清，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）以中和酸性的gan氨酸,。注意：為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步,。

可選實驗方案
方案一：
如需進行HA融合酶的活性檢測，無需洗脫，可以直接檢測,。
方案二：
如需進行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗,，主要用于含有HA融合蛋白的蛋白質(zhì)/DNA相互作用的實驗。染色質(zhì)免疫沉淀一般包括細胞固定,，染色質(zhì)斷裂,，染色質(zhì)免疫沉淀，聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),，DNA的純化以及DNA的鑒定,。其中前期細胞固定，染色質(zhì)斷裂不變,；然后接著直接進入說明書的第4步,，加入細胞裂解產(chǎn)物后，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合到HA-Nanoab-Agarose上,；
進入第5和6步,，分離得到復(fù)合物；進入第8步,，得到洗脫的復(fù)合物,；后期交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗,。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上,。
方案三：
HA-Nanoab-Agarose 不僅可以用于在體內(nèi)外檢測和驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可以結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白,。其操作步驟同免疫沉淀法,，得到洗脫的復(fù)合物后，然后進行SDS–PAGE分析,，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后,，切下未知蛋白的條帶,，用質(zhì)譜技術(shù)鑒定未知蛋白,。