副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒（帶內參,，PCR-熒光探針法） 

◆ 產(chǎn)品說明 動物病害檢測系列可針對動物組織、飼料,、糞便,、水樣等樣品中病原生物體的特異核酸片段進行 擴增，通過實時擴增曲線判定結果,。本產(chǎn)品用于副溶血性弧菌(VP)的檢測,，檢出限為 10 1copies/μL 。 

◆ 產(chǎn)品組成（48 測試） 031232RM 試劑 含量 A-VP/IPC-P 20μL × 8 管× 6 排 NG-P 100μL × 2 支 PG-VP/IPC-P 100μL × 1 支 IPC-P 100μL × 1 支

◆ 適用儀器 Gentier 32R,、Gentier 48E/48R,、Gentier mini、CFX 96 等實時熒光 PCR 儀,。 

◆ 自備耗材和儀器 冰盒,；移液器（0.5-10μL，10-100μL,，100-1000μL）及配套滅菌吸頭,；離心機；渦旋混勻器,；金屬?。痪|機,、 攪拌機或研缽等研磨器具,；電子天平。 ◆ 注意事項 1．本試劑檢測靈敏度高,。為了防止污染,，實驗要分區(qū)操作。 1）一區(qū)：樣本制備區(qū),。 2）二區(qū)：模板添加區(qū),。 3）三區(qū)：擴增及產(chǎn)物分析區(qū),。 ★ 分區(qū)之間好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染,。 2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套,，不同區(qū)域獨立使用工具，需更換手套和實驗服,。 3．嚴格按照操作步驟操作,，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。 4．反應液中的成分對光敏感,，應避光保存,。試劑使用前要解凍，但應避免反復凍融,，推薦使用前離心 30 秒,。 5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄,，當日清理,，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋,。 6．不同批號試劑請勿混合使用,，在有效期內使用。 

◆ 樣品處理 參照相關標準處理樣品,，制備的樣本保存待用,。 

◆ 實驗操作 1.模板制備（樣本制備區(qū)） 建議使用水生動物病原體基因組 提取試劑盒（FAST）等商品化試劑盒，具體過程詳見產(chǎn)品說明書,。 2.添加模板（模板添加區(qū),，放置于冰盒上進行） 剪下所需測試數(shù)的已含有反應液的 PCR 管，放置在室溫待解凍后,，離心 30 秒后打開管蓋,，向每管反應液中分 別加入 5μL 模板，順序為 NG,、待測樣品模板,、PG-VP/IPC-P,。蓋好配套的 PCR 管蓋后,，渦旋混勻 30 秒，離心 1min,， 立即進行 PCR 擴增反應,。 3. 擴增反應（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)） 使用熒光定量 PCR 儀，VP 熒光基團選擇 FAM,；內部對照（IPC）熒光基團選擇 VIC,。 按下列條件設置擴增反應：SM- 031232RM-D01 2 PCR 循環(huán) 熒光收集位點 去污染 50℃ 5 分鐘 1 個循環(huán) — 預變性 95℃ 5 分鐘 1 個循環(huán) — 擴增 95℃ 15 秒 45 個循環(huán) — 60℃ 30 秒 ※ 其他儀器請參照儀器說明書進行設置。 4．基線和閾值設定 進行軟件設置時，為目標基因 VP 和內參對照 IPC 分別設置特定的熒光通道,?；€調整取 3-15 個循環(huán)的熒光信 號，閾值線應超過陰性對照擴增曲線的高點,。 

◆ 結果判定 1,、質量結果判定 1）陰性對照：VIC 熒光通道 Ct>45，FAM 熒光通道 Ct>45,，無“S”型擴增曲線 2）陽性對照：VIC 熒光通道 Ct≤30,，FAM 熒光通道 Ct≤30，曲線呈“S”型擴增曲線 上述兩項若有一項不符合,，應重新進行擴增,；如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯(lián)系,。 2,、檢測結果判定 1 當檢測對蝦來源樣品，VIC 熒光通道應 Ct<45,，根據(jù) FAM 熒光通道進行結果判讀 1）FAM 熒光通道 Ct<40,，曲線呈“S”型擴增曲線，可報告樣品陽性,，含有副溶血性弧菌(VP),。 2）FAM 熒光通道 40<Ct<45，曲線呈“S”型擴增曲線,，判斷樣品可疑,，建議復檢；復檢后,，在陰陽性對照都 正常的前提下,，樣品 FAM 熒光通道 Ct<45，可判斷樣品含有副溶血性弧菌(VP),；樣品 FAM 熒光通道 Ct≥45,，可 判斷樣品不含有副溶血性弧菌(VP)。 3）FAM 熒光通道 Ct≥45,，無“S”型擴增曲線,，可報告樣品陰性，不含有副溶血性弧菌(VP),。如果 VIC 熒光 通道 Ct≥45,，建議重新提取樣品核酸進行復檢。 2 當檢測非對蝦來源樣品,，可在核酸提取時另加入 10μL 的 IPC-P 作為內部對照,，按以上規(guī)則進行結果判讀,。