1.樣本類型和采集：

血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置0.5-2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可,，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,，并將標本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果）,，稱重后將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整,，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨,。為了進一步裂解組織細胞,，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融,。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

細胞裂解液: 吸棄培養(yǎng)液，用PBS（0.01 M,，pH 7.4）將細胞洗一遍,。用細胞刮刮下細胞，加入2-5 mL PBS（0.01 M,，pH 7.4）,。懸浮細胞可省略。收集細胞懸液,，4℃ 1000×g離心10min,，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS潤洗3次,。加入適量的預(yù)冷PBS或非變性細胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細胞,通常6孔板一個孔的細胞量需要150-250μL PBS重懸,。 將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍,，再放室溫解凍樣品,，反復(fù)凍融3次，使細胞充分裂解,也可將樣品進行超聲破碎,，以達到裂解的目的,。4℃ 10000×g 離心10min，除去細胞碎片,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2.樣本保存和穩(wěn)定性

樣本在2-8℃條件下，可以儲存72h，在- 20℃或-80℃可以儲存6個月及以上,。樣本收集后,，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存,，避免反復(fù)凍融,。

步驟：

1. 編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔,、陽性對照2孔,、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）,。

2. 加樣：分別在陰,、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl,。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。  

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用,。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl,，空白孔除外。

7. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。

8. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次,，拍干,。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色10-20分鐘,。

10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。

11.測定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行,。

注意：

1. 試劑準備：試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,。準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下,，密封,，按照說明書要求保存，以備下次使用,。

2. 加樣：實驗操作中請使用一次性的滅菌吸頭,，避免污染。加樣時注意不要有氣泡產(chǎn)生,，將樣品加于酶標板底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,。與反應(yīng)試劑加入一樣,，加樣過程中第一個孔與最后一個孔加樣時間間隔盡量小（一般控制在10 分鐘以內(nèi)）,，如果太大,，將會導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性,。為了測值的準確性,，推薦設(shè)置復(fù)孔進行實驗。

3. 溫育：為防止樣品蒸發(fā),，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi),，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài),，同時應(yīng)嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4. 洗滌：濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果。充分洗滌非常重要,，在每次洗滌過程中,，都要將洗滌液*甩干。洗滌過程中反應(yīng)孔內(nèi)殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將吸水紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,，同時要輕輕擦除板底殘留的液體和手指印,，避免影響最后的酶標儀讀數(shù)。如果使用自動洗板機,，請在熟練使用后再用于正式實驗過程中,。

5. 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化，如觀察到顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過強而影響酶標儀光密度讀數(shù)。

6. 底物：底物請避光保存,，在儲存和溫育時避免強光直接照射,。