1.樣本類型和采集：

血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置0.5-2小時(shí)或4℃過(guò)夜,，然后1000×g離心20 分鐘,，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測(cè),，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨,。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融,。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

細(xì)胞裂解液: 吸棄培養(yǎng)液，用PBS（0.01 M,，pH 7.4）將細(xì)胞洗一遍,。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，加入2-5 mL PBS（0.01 M,，pH 7.4）,。懸浮細(xì)胞可省略,。收集細(xì)胞懸液，4℃ 1000×g離心10min,，棄去培養(yǎng)基,，用預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗3次。加入適量的預(yù)冷PBS或非變性細(xì)胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞,通常6孔板一個(gè)孔的細(xì)胞量需要150-250μL PBS重懸,。 將樣品放入-20℃或-80℃,，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品,，反復(fù)凍融3次,，使細(xì)胞充分裂解,也可將樣品進(jìn)行超聲破碎，以達(dá)到裂解的目的,。4℃ 10000×g 離心10min,，除去細(xì)胞碎片，取上清即可檢測(cè),，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè),，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2.樣本保存和穩(wěn)定性

樣本在2-8℃條件下,，可以儲(chǔ)存72h，在- 20℃或-80℃可以儲(chǔ)存6個(gè)月及以上,。樣本收集后,，不是一次檢測(cè)完，請(qǐng)按一次用量分裝凍存,，避免反復(fù)凍融,。

步驟：

1. 編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔,、陽(yáng)性對(duì)照2孔,、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）,。

2. 加樣：分別在陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照50μl,。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用,。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次,，拍干,。

6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外,。

7. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘,。

8. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10-20分鐘,。

10.終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測(cè)定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。

注意：

1. 試劑準(zhǔn)備：試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,。準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下,，密封,，按照說(shuō)明書要求保存，以備下次使用,。

2. 加樣：實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的滅菌吸頭,，避免污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡產(chǎn)生，將樣品加于酶標(biāo)板底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻。與反應(yīng)試劑加入一樣,，加樣過(guò)程中第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔加樣時(shí)間間隔盡量?。ㄒ话憧刂圃?/span>10 分鐘以內(nèi)），如果太大,，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間,，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。為了測(cè)值的準(zhǔn)確性,，推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。

3. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi),，以避免液體蒸發(fā),，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài),，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度,。

4. 洗滌：濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。充分洗滌非常重要，在每次洗滌過(guò)程中,，都要將洗滌液*甩干,。洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔內(nèi)殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將吸水紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,，同時(shí)要輕輕擦除板底殘留的液體和手指印,，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果使用自動(dòng)洗板機(jī),，請(qǐng)?jiān)谑炀毷褂煤笤儆糜谡綄?shí)驗(yàn)過(guò)程中,。

5. 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化，如觀察到顏色較深,，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

6. 底物：底物請(qǐng)避光保存,，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射,。